核酸的分离与提取10112017.ppt

免疫研究室易 浪,核酸的分离与纯化,核酸是遗传信息的载体，是重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的基本操作是分子生物学研究中最基本、最重要的技术之一。核酸的基本操作包括核酸的分离和纯化、检测和保存、凝胶电泳、分子杂交等。主要介绍核酸的分离和纯化相关内容,主要内容,DNA的提取与纯化RNA的提取与纯化,理化特性核酸都是极性化合物，微溶于水，而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。核酸溶于10%左右的氯化钠溶液，但在50%左右的酒精溶液中溶解度很小。核酸的提取时常利用这些性质。,一般原则,保持核酸结构的完整性，即保持核酸的天然状态，防止核酸酶的降解。,防止其他物质的污染：蛋白酶、金属离子、有机溶剂、多糖等。,防止化学因素（酸、碱或有机溶剂）及物理因素（机械剪切或高温）引起核酸变性和破坏。,注意事项,1尽量简化操作步骤，缩短提取过程，减少对核酸的破坏。2避免过酸、过碱等化学因素对核酸的降解。（pH 4-10）3减少物理因素对核酸的降解。主要是避免机械剪切力和高温。常规操作温度为0-4。4防止核酸的生物降解。,所用器械和一些试剂需高压灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为04。DNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等；阴离子表面活性剂SDS。RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）浸泡，器械180干烤8h。,主要步骤,1破碎细胞。2去除与核酸结合的蛋白质，多糖以及脂类等生物大分子。3去除其它不需要的核酸分子。4沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质。5核酸纯化。,基本方法,溶解法层析法电泳法超速离心法沉淀浓缩法,酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。,注意事项,DNA的提取和纯化,电泳法,层析法,DNA的提取和纯化,超速离心法,沉淀浓缩法,乙醇异丙醇聚乙二醇精胺,DNA的提取和纯化,DNA的提取与纯化,DNA的提取和纯化,基因组DNACTAB法SDS法,不同DNA的提取方法,质粒DNA碱裂解法煮沸法,线粒体DNA和叶绿体DNA差速离心结合SDS裂解法,DNA的提取和纯化,真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都可以用来制备基因组DNA。真核细胞的染色体DNA均为大分子量DNA，在提取操作时，必须把机械剪切力控制在最小，才能获得较大的DNA分子。细胞破碎物理方式包括超声波法、匀浆法、液氮破碎法、氧化铝粉(或石英砂)研磨法等，但这些物理操作均可导致DNA链的断裂。一般采用去污剂温和处理法。,基因组DNA的提取,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,CTAB法,CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide，十二烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液（0.7mol/L NaCL）中是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白质、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB在温度低于15时会有沉淀析出，使用前需要预热，离心时温度不得低于15,DNA的提取和纯化,Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中；-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。,经典配方,DNA的提取和纯化,PVP（聚乙烯基吡咯烷酮）是酚的络合物，可与多酚形成不溶的络合物，有效去除多酚；同时可以和多糖结合，有效去除多糖。,改良配方,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,SDS法,SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去垢剂，高温（5565）下可以裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放核酸。提高盐浓度病降低温度（冰浴），蛋白质、多糖、酚类析出沉淀，离心后去除。上清液可用有机溶剂反复抽提，乙醇沉淀可得到纯化的DNA。,DNA的提取和纯化,经典配方,流程图,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,质粒DNA的提取,碱裂解法煮沸法,DNA的提取和纯化,染色体DNA为大分子线性DNA，质粒DNA为共价闭合环状分子。质粒DNA为染色体外DNA，其分离和纯化需要最大限度地减少细菌染色体DNA的污染。碱裂解法是目前实验室中最常用的质粒DNA提取方法。基本原理是在碱性环境中，线性的染色体DNA变性，共价闭环质粒DNA再回到中性环境中可回复为自然状态。变性的线性DNA与变性的蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的环状DNA则溶解于溶液中，即可通过离心进行分离。,碱裂解法,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,煮沸法,染色体DNA为大分子线性DNA，质粒DNA为共价闭合环状分子。质粒DNA为染色体外DNA，其分离和纯化需要最大限度地减少细菌染色体DNA的污染。基本原理是煮沸后，线性的染色体DNA变性，共价闭环质粒DNA再回到中性环境中可回复为自然状态。变性的线性DNA与变性的蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的环状DNA则溶解于溶液中，即可通过离心进行分离。,DNA的提取和纯化,细胞器DNA的提取,差速离心结合SDS裂解法,DNA的提取和纯化,线粒体叶绿体,利用物质密度的不同分离混合物的一种方法。将带分离的混合物置于均匀介质（蔗糖）中，以一定速度进行离心，密度大的物质优先沉降，密度小的物质处于上层，从而进行分离。,差速离心结合SDS裂解法,小结（一）,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,DNA的提取和纯化,DNA提取常见的问题,DNA的提取和纯化,DNA降解,DNA的提取和纯化,DNA样品不纯,DNA的提取和纯化,DNA量少,RNA的提取和纯化,RNA的提取与纯化,RNA的提取和纯化,细胞中RNA的含量,RNA的提取和纯化,一般原则,RNA的分离纯化的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。,尽力抑制内源性RNA酶的活力，主要来源于样品中的组织细胞。,尽力避免外源RNA酶的污染，主要来于操作者的手、实验的器皿和试剂。,RNA的提取和纯化,注意事项,RNA的提取和纯化,RNA酶抑制剂,DEPC（焦碳酸二乙酯）和肝素。异硫氰酸胍，目前认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。RNA酶的特异抑制剂（1）RNA酶阻抑蛋白(RNasin)是一类从大鼠肝或人胎盘中提取出来的酸性糖蛋白，可与RNA酶结合，从而抑制其活性。（2）氧钒核糖核苷复合物是由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合后，几乎可完全抑制RNA酶的活性。其它如酚、氯仿和去污剂(如SDS)、蛋白酶K、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定的抑制作用。,RNA的提取和纯化,RNA的提取和纯化,RNA的提取和纯化,小结（二）,RNA的提取和纯化,RNA的提取和纯化,RNA的提取和纯化,RNA的提取和纯化,RNA的提取和纯化,RNA提取常见的问题,RNA的提取和纯化,RNA样品不纯,RNA的提取和纯化,RNA样品得率较低,RNA的提取和纯化,RNA样品降解,核酸的鉴定紫外分光光度法测定核酸浓度核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm，测定浓度应大于0.25g/ml。在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37g/ml；RNA为40g/ml。双链DNA样品浓度(g/l)=OD260核酸稀释倍数 50/1000；RNA样品浓度(g/l)=OD260核酸稀释倍数40/1000。,核酸的浓度和纯度的鉴定紫外分光光度法测定核酸纯度测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值 纯的DNA样品OD260/OD280=1.8（1.71.9）OD260/OD2302.0 1)OD260/OD2801.9,RNA污染。2)OD260/OD2801.6，存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD2302.0，溶液中有残存的盐和小分子杂质，如 核苷酸、氨基酸等。注:可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。,核酸的浓度和纯度的鉴定紫外分光光度法测定核酸纯度测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值 纯的RNA样品OD260OD280=2.0(1.72.0)OD260/OD2302.0 1）OD260/OD280比值太小，蛋白质或酚的污染；2）OD260/OD2802.0，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD2302.0，表明有小分子及盐存在。,核酸完整性的鉴定琼脂糖凝胶电泳 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳可判定核酸制品的完整性。基因组DNA如果发生降解，电泳图呈拖尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度应呈特定的比值。28S（或23S）RNA的荧光强度一般约为18S（或16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解 若在点样孔附近有着色条带，提示可能存在DNA的污染,谢谢大家！,