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荧光定量PCR基础 纲纲 要要 定量定量 PCR 介绍介绍 荧光定量荧光定量PCR化学原理化学原理 仪器的校正仪器的校正 定量定量PCR实验要素实验要素 数据分析数据分析 定量定量PCR常见故障排查常见故障排查 常见应用常见应用 定量定量 PCR 介绍介绍 什么是荧光定量什么是荧光定量PCR 指在指在PCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线值和标准曲线对样对样品中的品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法。的起始浓度进行定量的方法。定量定量PCR体系体系 普通的PCR体系 模板,引物,dNTPs,buffer,Taq酶 加入各种类型的荧光染料 定量定量PCR原理原理 与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行 理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍 每个循环结束后,定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信号 在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强 光学结构简图 典型的PCR四阶段 平台期 线性增长期 指数增长期 基线期 PCR理论方程 N=N0 x(1+e)n N=产物分子数 N0=起始分子数 E=扩增效率 n=循环次数 PCR方程只在指数期成立 荧光荧光PCR信号方程信号方程 什么是阈值阈值 高于背景荧光强度的值被确定为阈值 控制在扩增曲线的指数增长阶段范围之内。阈值线与扩增曲线的交叉点确定 CT 值。线性图谱 半对数图谱 CT值由阈值确定 Threshold（阈值）CT CT值：值：C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。数学关系数学关系 Log浓度与浓度与Ct呈线性关系，根据样品扩增达到阈值的循环数就可计算出呈线性关系，根据样品扩增达到阈值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。样品中所含的模板量。定量定量PCR的优点的优点 1.敏感度:可以检测低拷贝的目的基因。典型的单拷贝检测(如果有足够的 重复运行,泊松分布显示63%有扩增)2.高分辨率:1倍分辨率 3.动力学范围宽:约9个数量级.4.快:节省时间和劳力(不需要跑胶).5.安全:不用EB或放射性物质 荧光定量荧光定量PCR化学原理化学原理 两种化学方法 探针法探针法 染料法染料法 Taqman探针法原理探针法原理 完整的探针：5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET）退火，探针与模板结合，引物在聚合酶作用下进行延伸反应，遇到探针时发挥3-5外切酶活性将探针切碎到反应体系中 报告基团与淬灭基团距离变大，在激发光的作用下发荧光 TaqMan探针设计要点探针设计要点 TaqMan Probe Primer 尽可能地靠近上游引物（一般10个以内），最好是探针的5端离上游引物的3 有1个碱基。PCR产物大小建议50-150bp GC含量30-80%，避免发卡结构和二聚体 Tm值:68-70 Tm值:58-60 Probe长度：13-25bp(TaqMan MGB Probe)13-30bp（TaqMan Probe）Primer长度：20bp 终浓度：0.20.25uM 终浓度：0.2uM0.5uM 3端的前4个碱基不能有3个以上的G 3端的前5个碱基不能超过2个C/G 避免重复序列：避免序列中4个以上的G或连续6个A 选择C比G多的链当探针 5端第一个碱基不能为G，如为FAM，则第二个碱基也不能是G。5 端染料最好连接在T或C碱基上。MGB探针探针 R：荧光报告基团：荧光报告基团 NFQ：非荧光淬灭基团：非荧光淬灭基团 MGB：小沟结合物（增加探针：小沟结合物（增加探针Tm值）值）MGB探针的优势 提高信噪比 没有背景荧光 更高的淬灭效率 提高TmTm值 15 mer 提高18 探针更短只要13-19个碱基 更多一重PCR（淬灭基团不占通道）需要与模板序列完全匹配才可以结合（适合检测SNP）兼并、探针量高的情况也可结合 染料法原理染料法原理 SYBR Green I是一种DNA小沟结合染料 游离时不发光 与DNA结合时发光 每一轮反映结束后收集荧光，检测体系中双链产物的量。溶解曲线：溶解曲线：derivative view 反映结束后，温度逐步提升，双链产物在某一温度区域变性为单链，双链结合染料脱离出来，成为不发荧光的游离态。这一过程检测到的荧光值迅速降低，其监测值曲线即溶解曲线，不同产物的因其不同Tm值，会产生不同的溶解曲线峰。两种方法的比较两种方法的比较 优势 更特异 不需要考虑二聚体 可以进行多重反应 不需要优化 拥有已开发的试剂盒 不足 比较昂贵 优势 比较便宜 不足 特异性差 需要做融解曲线 不能进行多重反应 需要进行优化 须根据自行设计实验 TaqMan Sybr Green I 淬灭基团种类淬灭基团种类 荧光报告基团种类荧光报告基团种类 DABCYL 6-FAM，TET，JOE，HEX，Cy3等等 TAMRA 6-FAM，TET，JOE，HEX等等 BHQ1 6-FAM，TET，Cy3，JOE，HEX等等 BHQ2 Cy3，Texas Red，Cy5，TAMRA，ROX等等 BHQ3 Cy5，Cy5.5等等 报告集团及淬灭基团的选择报告集团及淬灭基团的选择vic 不同滤光片对应的发光集团不同滤光片对应的发光集团 滤光片 7000和7300荧光定量PCR系统 7500荧光定量PCR系统 A SYBRGreen I,FAM dyes SYBRGreen I,FAM dyes B VIC,JOE dyes VIC,JOE dyes C NED,TAMRA,NED,TAMRA dyes CY3 dyes D ROX dye ROX,Texas Red dyes E CY5 dye 仪器的校正仪器的校正 5 仪器的维护和校正仪器的维护和校正 误误差差来来源源 定义定义 纯荧光光谱：纯荧光光谱：标准荧光的光谱组分是用于荧光定量分析。ROX,SYBR,FAM，VIC，这些信息存储于计算机中，在数据分析的时候使用。荧光基团在PCR反应中与纯荧光比较得到准确的荧光计量。原始光谱视图（Raw Date）:显示PCR反应中荧光信号的软件视图 背景组分:仪器基座的背景“噪音”。背景噪音影响反应的灵敏度。背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除 纯荧光校正 纯荧光校正根据一系列荧光标准品收集荧光数据 软件将不同纯荧光标准品的荧光信息分析并存储到程序中 每次实验运行中，SDS 软件接收原始光谱信号。软件将原始光谱与纯荧光文件中包含的纯荧光标准进行比较，以确定样本中使用的每一种荧光的光谱表现 纯染料光谱纯染料光谱 FAM TAMRA VIC ROX NED SYBR Green ROI校正 ROI(Regions of Interest)校正用于生成目标区数据。由于定量PCR仪使用一组滤光片分离检测运行期间生成的荧光能量，所以必须为每个滤光片生成校正图像，以修正光学系统中的微小差异。校正期间生成的数据，允许SDS 软件映射样本块（Block)上反应孔的位置，从而在仪器操作期间，使软件可判断出反应板上特定反应孔中荧光强度的增量。背景校正背景校正 背景校正程序测量定量PCR仪的环境荧光强度 在运行校正程序期间，定量PCR 仪在 10 分钟内 连续地读取背景校正反应板的荧光强度，运行温 度为 60 随后，SDS 软件计算运行期间所收集到的荧光强度的平均值，提取出结果并保存到校正文件中 软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数据中减去背景信号 加热槽荧光污染的判断 执行背景校正，当背景荧光信号异常（强度超过72000或7500的滤光片E超过90000）时 实验中，连续出现不正常的偏高信号，并表明可能存在荧光物质污染时，需要清除热槽中的污染 清除热槽中的污染 清洁样本块中污染的反应孔 a.用移液器吸取少量水或乙醇并滴入每个污染的反应孔中。b.吹打数次。c.将废液吸入废液杯中。重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次 确认反应孔中的残留液体蒸发完 确认已除去热槽中的荧光污染物 运行背景校正板，确认污染已除去。如未除去，重新清洁，使用最新的背景校正 定量定量PCR实验要素实验要素 1.目标基因 样品 2.标准曲线 标准品 3.监控污染 阴性对照 4.监控系统故障 阳性对照 5.校准物理误差 参比荧光 1 目标基因目标基因 样品样品 细胞死亡时RNA迅速被RNases酶降解 另外，样本（组织，血液等）一旦离开机体后，基因表达谱会发生改变 可能的解决方案：将样本迅速完全融解在有机溶剂中 液氮冻存 将组织/细胞存放在稳定的溶液中 加入无毒的组织防腐剂和RNA稳定剂 选择样本的提取方法 有机溶剂法 提取的样本纯度高 劳动强度大 过柱法(玻璃纤维过滤)简单，各种样本类型都能提取到纯RNA 磁珠法 产量高，洗脱体积小 不需要离心，适合高通量提取 选择RT-PCR方法 将未知RNA直接加入到实时定量PCR反应管中 接着，加入含逆转录酶和Taq酶的反应液 RT反应完成后，立即进行PCR 优势：节省加样步骤 注意点:样品反复冻融会造成RNA降解（小量等份分装）先将RNA逆转录成cDNAs 将cDNAs 1:2 1:10 稀释 加入反应板中，实时扩增cDNA，或-20 C储存（稳定保存数周）优势：cDNA远比RNA稳定，可以反复冻融多次 不足：和一步法相比，需要更多的加样步骤 一步法一步法 两步法两步法 预扩增 传统的基因表达分析 包含预扩增的基因表达分析 1:5 or 1:20 稀释 10-14 PCR 循环 预防 PCR 过程中的污染 进行新的扩增反应时，很容易被前一次扩增产物污染（比如：通过气溶胶污染，被污染的移液器等）污染的模板被扩增会影响实验的结果 体系中掺入尿嘧啶的扩增产物会被UDG酶降解 作用于含有dU掺入的DNA模板 50 激活UDG.残留污染被降解(因此不会被扩增).95 灭活UDG 目标样品用量 DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6-2.0之间 DNA用量：0.1ng-100ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：10-100ng 2 标准曲线标准曲线 标准品标准品 定量实验中，单独的Ct值本身是没有意义的，需要通过标准曲线，将其转化成有意义的数值。标准品（浓度/拷贝数）目的：目的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系 不要求：不要求：数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA 可以使用相同的DNA 也可以使用不同的：PCR产物、质粒质粒、病毒、人工合成片段 要求：要求：浓度已知，Ct值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间 制备至少5个点的10倍标准曲线(4 logs）PCR效率一致，且接近100%与未知样本实验条件平行 每个点至少3次重复 制作标准曲线 选择目标提取/PCR 纯化测定浓度 调整浓度梯度稀 检查相关系数 R2 0.99 Eff%=90%-110%Slope=-3.58-3.10 理想的斜率理想的斜率=-3.32（对应（对应100%扩增效率）扩增效率）；效率在效率在90%-110%（斜率为（斜率为-3.58到到-3.10 之间）都表示扩之间）都表示扩增较好增较好 去除离散值的点 选择离散的孔，右键点击“去除”3 监控污染监控污染-阴性对照阴性对照 实验效果验证 种类 No Template Control No RT Control No Probe Control 如何分析电泳 融解曲线 测序 No RT Control 探针可能检测到基因组DNA 1.用DNase酶处理样本 2.检测no-RT对照（不进行逆转录的样本）+RT 和和RT 应该至少应该至少相差相差6-7 Cts (大约大约1%信号由信号由DNA产生产生).+RT-RT 4 阳性对照阳性对照-监控系统故障监控系统故障 内参内参(管家基因)标准品线性范围 灵敏度 扩增效率 外源阳性内对照 来源PCR产物 质粒 阳性样本 内参-校准生物学误差 内参用于校准实验过程对定量结果的影响核酸提取时通常以重量或体积为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源于等量细胞（或基因组）将定量结果校正为以细胞（或基因组）为单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：目的基因/内参=均一化的目的基因表达量 内参可以起到阳性对照的作用，以监控反应系统是否正常，试剂、PCR程序、荧光采集、是否存在抑制物 内参常选用管家基因，如18S rRNA、-actin、GAPDH等 5 ROX 参比荧光参比荧光-校准物理误差 Master Mix中Rox浓度固定 ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Master Mix用量有关 ROX的功能：耗材质量（如管盖厚度、透光性能）、仪器稳定性（如孔 间、批间波动）等的误差，反应体系监控(蒸发)校正方式：Rn=RReporter/RROX 提高复孔间的精确度 进行ROX 参比荧光校 准后后36个复孔分析结 果.未进行ROX 参比染料 校准的36个复孔分析结果.数据分析数据分析 绝对定量与相对定量 绝对定量：优点:给出目标基因的绝对数量，数据容易处理 缺点：必须有标准品，做标准曲线，难以制备和质控 相对定量 优点：可以不做标准品；相对标准曲线法的标准品容易制备；使用广泛 缺点：数据理解困难 绝对定量举例 绝对定量数据处理绝对定量数据处理 如果需要对不同样本的绝对定量数据进行比较，则需内参校准 相对定量：相对标准曲线法 标准品只知道标准品只知道稀释倍数稀释倍数 相对定量：CT法 依据：平均相对含量%=2 平均CT 好处：不做标准曲线 CT=（CT未知样品-CT未知样品内参）-（CT基准样品-CT基准内参）CT法计算示例 比较Ct值的数学关系 Ct为1=2倍差异 Ct为2=4倍差异 Ct为3=8倍差异 Ct为3.3=10倍差异 形成这种数学关系的前提：每经过1个循环，产物的量会加倍在这种情况下，反应的扩增效率为100%如果扩增效率下降 这种数学关系不再成立 PCR效率对定量结果的影响 导致扩增效率达不到 100%的原因 1.实验组分的浓度及质量。如果样品包含PCR抑制剂，反应会减慢，甚至不反应。这种情况常见于来自生物制品样本的核酸。cDNA作为起始模板时很少见。2.扩增产物太长实时定量PCR检测建议扩增产物序列长度为50-150碱基 3.没有选择合适的引物退火温度 4.设计的引物有错配 5.模板序列特殊（比如：GC含量高）6.二级结构的影响（引物、探针、扩增产物）定量定量PCR常见故障排查常见故障排查 无扩增曲线无扩增曲线 1.通过电泳检测无条带，也无扩增曲线 a.引物设计问题 b.引物质量问题 c.扩增体系问题 d.退火温度问题 2.电泳检测有条带，但无扩增曲线 a.程序设定问题或仪器出现故障 b.探针合成问题 c.探针淬灭 阴性对照起飞阴性对照起飞 1.无模板阴性对照起飞 a.探针污染 b.引物污染 c.体系污染 建议：做无探针对照，无引物探针对照，电泳查看有无条带，确认污染源后重合引物或探针或更换试验体系。2.no-RT对照阴性对照起飞 基因组DNA污染，+RT 和RT 应该至少相差6-7 Cts(大约1%信号由DNA产生).建议：设计引物时至少有一个跨内含子 3.Sybergreen法在35个循环之后阴性对照起飞 体系中组份的非特异扩增，引物二聚体的自我延伸 4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。扩增曲线不平滑扩增曲线不平滑 1.探针与模板结合不稳定（曲线不平且荧光值低）a.原始序列不准确或有SNP，导致探针不宜结合 b.将文献中的MGB探针序列直接合成taqman探针，退火温度过低 2.仪器或试剂问题 参考平行内参阳性对照扩增曲线 3.罗氏lightcycler1.0或2.0要在体系中加BSA封闭 4.调整探针或染料浓度 斜线型曲线斜线型曲线 1.探针降解（本底荧光值高）可以使用变性PAGE胶检测是否降解 2.体系中含有抑制成分 异常曲线异常曲线 某一条曲线与其他不平行 体系中含有抑制成分 不能用于分析 溶解曲线出现多个峰溶解曲线出现多个峰 1.引物非特异扩增 2.引物二聚体 3.基因组DNA污染：在检测cDNA的时候，同时扩增出含有内含子的较长的基因组上的片段。解决方法：设计引物时，至少有一条跨过两个外显子的接合处，使其无法与含有内含子的基因组DNA结合 生物信息学分析不完全导致的风险 实验设计.包含SNP 位点引物/探针和靶序列无效结合 错误序列无效结合，甚至根本未结合 转录组中序列并不单一 非特异性扩增 序列包含重复片段大量非特异性扩增 注意事项 实验室分区：样品处理区、PCR反应制备区、扩增区 标准品的稀释最好使用独立的一套移液器 标准品的稀释液中最好含有Carrier RNA 移液器使用带滤芯的吸头 先阴性对照样，后加样品，再加低浓度标准品，最后加阳性对照 PCR管上不可用记号笔标记 PCR管使用平盖或光膜，不要裸手触摸光盖或光膜表面 PCR管或8联排管要对称放置 反应后的PCR管应当直接废弃，切不可在实验区域内开启 采用UNG防污染系统，消除前次扩增产物的污染影响 常见应用常见应用 1 SNP分析 TaqMan-MGB基因分型 针对等位基因设计引物对，实现PCR扩增 针对SNP位点设计探针，分别标记不同的荧光基团，如等位基因I型探针标记VIC，等位基因II型探针标记FAM 通过散点图显示结果 平台期终点信号散点图 VIC(allele 1)on X-axis FAM(allele 2)on Y-axis 每个数据集代表一种基因型：每种纯合子、杂合子和无模板对照（NTC）1:1 in VIC cluster 1:2 in VIC+FAM cluster 2:2 in FAM cluster 2 miRNA 检测 成熟的MicroRNA(miRNA)是一种22个nt左右的内源性单链小分子RNA 由带茎环结构的双链RNA前体剪切而成 具有高度保守性、时序性和组织特异性 通过与特异mRNA结合，抑制目标基因表达或降解mRNA 调节人类三分之一的基因 TaqMan MicroRNA Assays 成分：1.RT primer 2.Forward primer 3.Reverse primer 4.TaqMan probe 优点 1.高特异性:能区分前体和成熟miRNA。2.高灵敏度:1-10ng样本。3.精确度高，动态范围宽，不同拷贝都能检测。4.高效：3小时同时检测多达365个miRNA。3 蛋白表达定量 基于双抗体的同源检测试剂,每个抗体上绑定了一段Oligo(通过生物素-链霉亲和素偶联)当2个偶联了Oligo的抗体结合了靶蛋白时，2段Oligo空间位置接近，从而可以被连接酶连接，即可构成定量PCR扩增模板 广泛使用 拷贝数多态性（拷贝数多态性（CNV）食品安全检测食品安全检测 转基因样品拷贝数检测转基因样品拷贝数检测 疾病检测疾病检测