荧光定量PCR基础纲要定量PCR介绍荧光定量PCR化学原理仪器的校正定量PCR实验要素数据分析定量PCR常见故障排查常见应用定量PCR介绍什么是荧光定量PCR指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。定量PCR体系•普通的PCR体系•模板,引物,dNTPs,buffer,Taq酶•加入各种类型的荧光染料定量PCR原理•与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行•理论上每经过一个循环目的基因的数量都会增加一倍•每个循环结束后,定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信号•在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强光学结构简图典型的PCR四阶段平台期线性增长期指数增长期基线期PCR理论方程N=N0x(1+e)nN=产物分子数N0=起始分子数E=扩增效率n=循环次数PCR方程只在指数期成立荧光PCR信号方程什么是阈值•高于背景荧光强度的值被确定为阈值•控制在扩增曲线的指数增长阶段范围之内。阈值线与扩增曲线的交叉点确定CT值。线性图谱半对数图谱CT值由阈值确定Threshold（阈值）CTCT值：C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。数学关系•Log浓度与Ct呈线性关系，根据样品扩增达到阈值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。定量PCR的优点1.敏感度:可以检测低拷贝的目的基因。典型的单拷贝检测(如果有足够的重复运行,泊松分布显示63%有扩增)2.高分辨率:1倍分辨率3.动力学范围宽:约9个数量级.4.快:节省时间和劳力(不需要跑胶).5.安全:不用EB或放射性物质荧光定量PCR化学原理两种化学方法探针法染料法Taqman探针法原理•完整的探针：5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET）•退火，探针与模板结合，引物在聚合酶作用下进行延伸反应，遇到探针时发挥3′-5′外切酶活性将探针切碎到反应体系中•报告基团与淬灭基团距离变大，在激发光的作用下发荧光TaqMan探针设计要点TaqManProbePrimer尽可能地靠近上游引物（一般10个以内），最好是探针的5'端离上游引物的3'有1个碱基。PCR产物大小建议50-150bpGC含量30-80%，避免发卡结构和二聚体Tm值:68-70℃Tm值:58-60℃Probe长度：13-25bp(TaqManMGBProbe)13-30bp（TaqManProbe）Primer长度：20bp终浓度：0.2~0.25uM终浓度：0.2uM~0.5uM3’端的前4个碱基不能有3个以上的G3’端的前5个碱...
