常见重组蛋白纯化[bioworlde.com].pdfVIP免费

常见重组蛋白的纯化韦新桂(Chromatography)北京韦氏博慧色谱科技有限公司，www.wsac.cn,weixingui@263.net前言：近年来随着生物技术的进步，特别是基因工程的迅猛发展，表达蛋白已经变得很容易，相对而言，纯化却是一个非常繁杂的工作，所以越来越多的研究者把需要表达的目标蛋白和亲和纯化用的标签融合表达，这样纯化相对得比较容易，即使如此，由于蛋白的多样性，纯化依然是比较复杂而专业的工作，尤其对于不熟悉纯化的研究者而言，它成为一个项目的瓶颈，本手册就是把一些相关的材料汇集，希望对纯化重组蛋白有所帮助。1．1常见纯化的标签理想的标签需要有以下的几个特点，1最好能一步纯化得到纯品；2对目标蛋白的结构和活性没有影响；3方便切除标签；4应用范围广，可适用各种表达系统或目标蛋白。但是没有哪个标签是完美的，只能根据实际需要去自己筛选，下表是部分的标签以及纯化的方案：标签纯化用的填料或配基洗脱方法多聚组氨酸（6XHis）螯合镍、铜、钴离子的填料咪唑或降低pH谷胱甘肽硫转酶（GST）键合谷胱甘肽的亲和填料10-20mM还原谷胱甘肽麦芽糖结合蛋白（MBP）淀粉琼脂糖凝胶麦芽糖金黄色葡萄球菌蛋白AIgG琼脂糖凝胶低pHFlagpeptide抗Flag抗体,M1,M2低pH或EDTA多聚精氨酸（Poly-Arg）SP琼脂糖凝胶高盐多聚半胱氨酸（Poly-Cys）活化巯基琼脂糖凝胶DTT多聚苯丙氨酸（Poly-Phe）苯基琼脂糖凝胶乙二醇钙调蛋白结合肽钙调蛋白EGTA纤维素结合域纤维素盐酸胍或脲几丁质结合域几丁质巯基乙醇，半胱氨酸由于篇幅有限，手册只只写多聚组氨酸标签、GST融合蛋白。2．组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。2．1IMAC(ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography)是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次...