第三章：酶的分离纯化酶分离纯化的目标：使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度。要点：酶主要还是蛋白质，能用于蛋白质的分离纯化方法通常可用于酶。要尽量减少酶活损失。要分清是胞内酶还是胞外酶根据酶的用途采用不同的方法3.1酶分离纯化流程酶原液否胞内酶细胞破碎提取分离浓缩干燥预处理细胞分离3.2酶纯度的评价总活力的回收率比活力提高的倍数酶的纯度实用价值＜－－侧重科研3.2.1酶总活力回收率与提纯倍数1总活力的回收率：反映提纯过程酶活力的损失情况。总活力的回收率＝纯化后总活力/纯化前总活力*100%2提纯倍数：反映纯化方法的效率纯化倍数＝纯化后的比活/纯化前的比活示例：腺苷酸激酶纯化表（6kg猪肉）纯化步骤总体积总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率抽提16600435000.04130.951100mlmgkatalkatal/kg%调pH15700112003.25层析1380171613.02凝胶过滤21146243.17结晶-34446.53.2.2酶的纯度检验注意标明使用何种方法检验的.不同方法检验的纯度可能不一致。如电泳纯、层析纯、HPLC纯。常用的检验酶纯度的方法方法特点超速离心检测杂质＜5%时不太满意，不适合络合解离体系电泳必须在多种pH值下进行，单一pH两种酶可能一起移动SDS－电泳可测出分子量，多亚基时会出现多条区带等电聚焦检测杂的极灵敏方法，有时会出现表观异质现象N－末端分析只适用于一条肽链免疫技术高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦3.3分离与纯化分离（提取）：在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中。纯化：通常先根据溶解度性质用沉淀的方法（如盐析、有机溶剂沉淀等），制得粗酶，再根据酶分子的大小、电荷性质、亲和专一性，将酶纯化。3.3.1细胞破碎的方法机械破碎法物理破碎法化学破碎法酶促破碎法P72-733.3.2酶提取的方法盐溶液提取法酸溶液提取法碱溶液提取法有机溶剂提取法p76根据酶的溶解性质，选择适当的溶剂。3.3.3影响酶提取的主要因素1提取目标:提高提取率减少酶活损失。1)温度：温度过高易导至酶失活，应控制在0－10℃，对于稳定性高的酶提高温度有利于提取。2）pH:pH应远离等电点以提高溶解度，但pH不宜过高或过低，防止酶失活。3)提取液用量：用量增加，提取率增加但分离成本提高。一般为原液的3-5倍4)添加保护剂：加入适量的酶作用底物、辅酶或抗氧化剂可以提高酶稳定性，减少酶活损失。1分离过程中新设备、新技术的应用会取得事半功倍的效果。如离心机、过滤机的选择。采用膜分离技术...
