抑制副溶血性弧菌的乳酸菌筛选鉴定及其生物学特性研究.pdf

基金项目：浙江省基础公益研究计划（编号：）；浙江省生物工程重中之重学科项目（编号：）；浙江省“生物工程”一流学科（类）学生创新计划项目（编号：）作者简介：于晨，女，浙江万里学院在读硕士研究生。通信作者：袁勇军（），男，浙江万里学院教授，硕士生导师，博士。：收稿日期：改回日期：犇 犗 犐：犼 狊 狆 犼 狓 文章编号 （）抑制副溶血性弧菌的乳酸菌筛选鉴定及其生物学特性研究 ，犞 犻 犫 狉 犻 狅狆 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊于晨犢 犝犆 犺 犲 狀杨露犢 犃犖犌犔 狌管峰犌 犝 犃犖犉 犲 狀 犵张捷犣犎犃犖犌犑 犻 犲袁勇军犢 犝犃犖犢 狅 狀 犵 犼 狌 狀（浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 ）（犆 狅 犾 犾 犲 犵 犲狅 犳犅 犻 狅 犾 狅 犵 犻 犮 犪 犾犪 狀 犱犈 狀 狏 犻 狉 狅 狀 犿 犲 狀 狋 犪 犾犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲 狊，犣 犺 犲 犼 犻 犪 狀 犵犠 犪 狀 犾 犻犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔，犖 犻 狀 犵 犫 狅，犣 犺 犲 犼 犻 犪 狀 犵 ，犆 犺 犻 狀 犪）摘要：目的：丰富功能性乳酸菌资源库，寻找具有副溶血性弧菌拮抗能力的优良乳酸菌出发菌株。方法：采用牛津杯抑菌试验筛选具有广谱抑菌潜力的乳酸菌菌株，通过生长代谢性能、胃肠液耐受性能、耐盐性、抗生素敏感性、抑菌谱等指标探讨其生物学特性。结果：以副溶血性弧菌为指示菌，筛选得到株乳酸菌，经形态学、生理生化、分子生物学鉴定，分别归类于类干酪乳酪杆菌、发酵黏液乳杆菌和植物乳植物杆菌。其中，类干酪乳酪杆菌 抑菌活性最佳，内菌落总数超过 ，发酵液 值稳定在左右，经人工模拟胃液处理后，存活率为 ，再经人工模拟肠液处理后，存活率仍可达 ，经 胁迫处理 后，活菌总数 。同时，类干酪乳酪杆菌 细菌素粗提物对 种致病菌呈良好抑菌活性，具有广谱抑菌潜力，且对种常见抗生素未见耐药性。结论：筛选得到了能够抑制副溶血性弧菌且生物学特性优良的类干酪乳酪杆菌。关键词：副溶血性弧菌；类干酪乳酪杆菌；筛选；鉴定；生物学特性犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋：犗 犫 犼 犲 犮 狋 犻 狏 犲：犞 犻 犫 狉 犻 狅狆 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊 犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊：犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 ，犚 犲 狊 狌 犾 狋 狊：犞狆 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊 犔狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻，犔犳 犲 狉 犿 犲 狀 狋 狌 狊 犔狆 犾 犪 狀 狋 犪 狉 狌 犿 ，犔狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻 ，犔狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻 ，犆 狅 狀 犮 犾 狌 狊 犻 狅 狀：犔狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻，犞狆 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊 ，犓 犲 狔 狑 狅 狉 犱 狊：犞 犻 犫 狉 犻 狅狆 犪 狉 犪 犺 犪 犲 犿 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊；犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻；副溶血性弧菌为常见水产源食品致病菌，下可快速繁殖，引起食品污染。大量研究结果显示，国内外水产动物均存在副溶血性弧菌携带情况，携带率约为 ，夏季水温升高时，水体中固有的副溶血性弧菌大量繁殖，容易引起鱼虾蟹的爆发性死亡，造成重大 第 卷第期 总第 期 年月经济损失。与此同时，食用被副溶血性弧菌污染的食物，会引起腹痛、腹泻、发热、呕吐等多种肠胃炎症状，严重时甚至会引起休克、死亡。年中国 起食物中毒事件中，由副溶血性弧菌引发 起，发病 例，占发病总人数的 ，副溶血性弧菌已成为食源性疾病头号致病菌。此外，副溶血性弧菌正逐步向北欧等国家扩展，且环境污染使其变异性和抗药性进一步加强。目前，副溶血性弧菌的防控方法主要有化学防控和生物防控，但化学药物引起的环境污染会使其变异性和抗药性进一步加强，益生菌防控因具有环境友好、生物安全等优点逐渐兴起。乳酸菌及其相关制剂因具有维持肠道菌群平衡，增强机体免疫力和抑制病原菌侵害的功能，被广泛应用于食品工业中。目前，有关饲用乳酸菌添加剂类及乳品发酵类优良乳酸菌的筛选鉴定的报道较多 ，但有关副溶血性弧菌等食品致病菌防控的乳酸菌的筛选报道较少。研究将以副溶血性弧菌为指示菌，通过牛津杯抑菌法从大弹涂鱼肠道、发酵酸奶、健康母乳及婴幼儿粪便等环境中筛选乳酸菌菌株，对排除酸性产物影响后，代谢产物仍具有抑菌活性的乳酸菌分离株进行生理生化鉴定和 测序，并选取抑菌活性最高的乳酸菌分离株进行相关生物学特性评价，确保菌株具有良好的安全性与应用潜力，为后续应用于食品致病菌防控的益生菌制剂制备提供优良出发菌株。材料与方法材料样品来源样品分离自大弹涂鱼肠道、发酵酸奶、健康母乳及婴幼儿粪便。指示菌株白色念珠菌 、马红球菌 、蜡样芽 孢 杆 菌（上 海 疾 控）、莱 什 曼 氏 乳 杆 菌 、单增李斯特氏菌 、金黄色葡萄球菌 、阪崎肠杆菌 、大肠埃希氏菌 、鼠伤寒沙门氏菌 、副溶血性弧菌 、荧 光 假 单 胞 菌 、哈 维 氏 弧 菌 、溶藻弧菌、嗜水气假单胞菌：浙江万里学院微生物实验室保存。主要试剂和仪器 肉汤、营养肉汤、固体培养基：青岛海博生物技术有限公司；人工胃液（，无菌）、人工小肠液（，无菌）：上海源叶生物科技有限公司；戊二醛电镜固定液：泉州以达科技有限公司；细菌基因组 提取试剂盒：美国 公司；大容量全温度恒温培养振荡器：型，金坛市盛蓝仪器制造有限公司；台式冷冻离心机：型，德国赛默飞世尔科技有限公司；酶标仪：型，德国赛默飞世尔科技有限公司；仪：型，德国艾本德公司；凝胶成像系统：天能 型，上海天能科技有限公司；冷冻浓缩仪器：型，美国 公司；生物扫描电镜：型，日本 公司。试验方法抑制副溶血性弧菌乳酸菌菌株的筛选取样品稀释，涂布于 平板，培养，挑选具有溶钙圈的菌株，制备种子液，以体积分数接种量接种于 液体培养基，静置发酵，、离心 ，取 上 清 液 真 空 冷 冻 干 燥，用倍 无 菌 水 复 溶，滤膜过滤，保存备用。取对数生长期的副溶血性弧菌，菌液浓度调至 ，接种 固体平板，放置牛津杯，分别加入 浓缩发酵液和 调为的浓缩发酵液，测量其抑菌圈直径。菌种鉴定（）形态学鉴定：通过牛津杯试验挑选具有抑菌潜力的菌株，取单菌落革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体大小、形状、颜色及排列方式等。（）生 理 生 化 鉴 定：挑 选 革 兰 氏 阳 性 菌，参 照 对菌株进行常规生理生化试验。（）分子生物学鉴定：利用基因组 提取试剂盒的方法提取菌株总，参照章检明等 的方法进行 序 列 扩 增。其 中，正 向 引 物 ：，反 向 引 物 ：。反应条件：预变性 ；变性 ，复性 ，延伸，次循环；延伸 。将 产物回收送至上海生物工程有限公司测序。菌株电镜表征取对数生长期的抑菌活性最高的乳酸菌分离菌株，用 磷酸缓冲液漂洗两遍，再用新鲜的戊二醛电镜固定液固定，送至南京宁标科技检测有限公司进行扫描电镜观察细菌表面特征。菌株生长产酸曲线将乳酸菌分离株以体积分数接 种 量 分 别 接 种 于 液 体 培 养 基 中，、震荡培养，每隔测量 和 值，共计。以培养时间为横坐标，以 和 值为纵坐标绘制菌株生长产酸曲线。菌株人工胃肠液耐受性根据冯艳琴等 的方法，按式（）、式（）分别计算人工胃液和人工小肠液中菌株存活率。犛犃犃 ，（），于晨等：抑制副溶血性弧菌的乳酸菌筛选鉴定及其生物学特性研究式中：犛 人工胃液中菌株存活率，；犃 耐受人工胃液的活菌数，；犃 耐受人工胃液的活菌数，。犛犅狀犅 ，（）式中：犛 人工小肠液中菌株存活率，；犅 耐受人工小肠液的活菌数，；犅狀 耐受 人 工 小 肠 液，的 活 菌 数，。菌株耐盐性参照杨小慧 的方法并修改。挑取乳酸菌分离株单菌落接种于 液体培养基中，恒温静置培养至对数期，以体积分数接种量接种于 质 量 浓 度 分 别 为，的 液体培养基中，静置培养，梯度稀释涂布计数，每组个平行，按式（）计算耐盐率。犛犆狀犆 ，（）式中：犛 菌株耐盐率，；犆 含量为的 肉汤中的活菌数，；犆狀 含量为，的 肉汤中的活菌数，。菌 株 抗 生 素 敏 感 性以 金 黄 色 葡 萄 球 菌（犛 狋 犪 狆 犺 狔 犾 狅 犮 狅 犮 犮 狌 狊犪 狌 狉 犲 狌 狊）为质控菌株，按体积分数接种量接种于 肉汤，、震荡培养；以乳酸菌分离株为试验菌株，按体积分数接种量接种于 肉汤，静置培养。将质控菌株均匀涂布于 固体平板，将试验菌株涂布于 固体平板。将不同种类的药敏片分别贴于两种平板表面，每个平板贴张抗生素药敏片，每个平板各设组平行，质控菌于 培养，试验菌于 培养，分别测量其抑菌圈直径，并按表进行药敏性判定。表不同抗生素药敏性判定标准 抗菌药片含药量（片）药敏性判断标准阿莫西林 氯霉素 利福平 四环素 头孢噻吩 庆大霉素 青霉素 氟苯尼考 敏感；中度敏感；耐药。细菌素粗提物抑菌谱参照吴惠贞 的方法。数据处理利用 构建系统发育树，进行显著性分析，显著性水平设置为犘，每组试验设个平行，作图。结果与分析抑制副溶血性弧菌乳酸菌的筛选通过溶钙圈法筛选得到 株产酸菌株，再通过牛津杯抑菌试验，复筛出株排除酸性产物干扰后仍对副溶血性弧菌有明显抑制作用的菌株（、）。由图可知，调酸前，菌株对副溶血性弧菌的抑菌圈直径由大到小依次为 ，抑菌圈直径均，抑菌活性优良。调酸后，以相同 值乳酸为对照，乳酸对副溶血性弧菌的生长未表现出抑制作用，株菌株抑菌圈直径由大到小依次为 ，抑菌圈直径为 ，抑菌效果较调酸前显著减小（犘 ）；以 培养基为对照，排酸后，培养基不呈现抑菌活性。吕蕾等 研究发现，当 为时，可排除酸性产物对抑菌活性的影响，株复筛菌的代谢产物排除酸性产物干扰后仍对副溶血性弧菌保留抑菌活性，推测可能含有乳酸菌细菌素类成分。大写字母不同表示差异显著（犘）；为未检出图调酸前后各菌株抑菌效果对比 菌种鉴定菌体形态和生理生化鉴定株复筛菌株菌落均呈圆形，凸起，为白色或乳白色，边缘齐整，表面湿润光滑，直径约为（）。由表可知，革兰氏染色后光学显微镜下初步判断，均为革兰氏阳性菌，呈链状或单个排列，无芽 孢。各 菌 株 生 理 生 化 特 征 结 果 与 中乳杆菌生化特征描述相符，初步确定复筛细菌均为乳杆菌。分子生物学鉴定由图可知，以各乳杆菌分离株 为 模 板，经 扩 增 获 得 长 度 为 的 碱基序列。将测序结果进行同源比对后构建基础研究 总第 期 年月表复筛菌株生理生化特征 检测指标 七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨苷山梨醇蔗糖棉子糖菊糖乳糖马尿酸钠“”表示阳性；“”表示阴性。图复筛菌株 电泳图 系统发育树，如图所示。菌株 与类干酪乳酪杆菌（犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻）亲缘关系最近，菌株、与发酵黏液乳杆菌（犔 犻 犿 狅 狊 犻 犾 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊 犳 犲 狉 犿 犲 狀 狋 狌 犿）亲缘关系最近，菌株、与植物乳植物杆菌（犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊狆 犾 犪 狀 狋 犪 狉 狌 犿）亲缘关系最近。结合菌落形态鉴定、生理生化鉴定和分子生物学鉴定，确定菌株 为类干酪乳酪杆菌，菌株、为发酵黏液乳杆菌，菌株、为植物乳植物杆菌。类干酪乳酪杆菌因具有促进肠胃蠕动、增强机体免疫能力等功能，且无毒副作用、易被人体降解，逐渐成为颇具潜力的工业微生物，且部分类干酪乳酪杆菌能够抑制副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等食品致病菌的生长。因此，选取排除酸性产物干扰后抑菌 活 性 最 强 的 类 干 酪 乳 酪 杆 菌（犔 犪 犮 狋 狅 犫 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊狆 犪 狉 犪 犮 犪 狊 犲 犻，）继续探索其生长产酸性能、人工胃肠液耐受性、耐盐性、抗生素敏感性等生物学特性。形态特征由图可知，经 加速电压进行场发射扫描电镜观察，菌体表面完好，无鞭毛和荚膜，以单个形式排列，无分支，分散效果良好，边界明亮清晰，呈短杆状，长宽比约为。图复筛菌株系统进化树 图 场发射扫描电镜图 生长产酸曲线由图可知，菌株在 呈指数增长，时 达到稳定状态，指数生长期内 菌 落 总 数 达 以上，菌 株 生 长 旺 盛。由 产 酸 曲 线 可 知，发酵液原始 值为，对数生长期内，发酵液 值迅速下降，后发酵液 值稳定在左右，菌株产酸旺盛，具有良好代谢能力。图 生长产酸情况 ，于晨等：抑制副溶血性弧菌的乳酸菌筛选鉴定及其生物学特性研究 人工模拟胃肠液耐受性由图可知，经人工模拟胃液（）处理，存活率可达 ，再经人工模拟肠液继续处理，其存活率分别为人工模拟胃液处理后细菌总数的 ，。人 工 模 拟 胃 液（）处理，活菌数显著下降（犘）；人工模拟肠液处理，活菌数亦显著降低（犘），经人工模拟肠液继续处理，活菌数无显著差异。人 工 模 拟 肠 液 消 化后，活 菌 数 仍 高 于 ，具有良好的胃肠液耐受能力。这与黄桂东等、余萍等 的研究结果基本一致。小写字母不同表示差异显著（犘）图 在人工模拟胃肠液中的生长情况 由图可知，活菌数随盐浓度的上升而下降，当盐浓度为时，活菌数呈指数下降，其存活率分别为 ，当盐浓度为 时，活菌数下降减缓，其存活率分别为，以 盐浓度胁迫处理，活菌数仍在 以上，呈现良好的盐应激适应能力，具有应用于高盐环境食品致病菌防控的优良潜力。抗生素敏感性由表可知，对阿莫西林、氯霉素、利福平、四小写字母不同表示差异显著（犘）图 不同盐浓度耐受情况 表 药敏试验结果 抗生素种类犛 狋 犪 狆 犺 狔 犾 狅 犮 狅 犮 犮 狌 狊犪 狌 狉 犲 狌 狊抑菌圈直径判定标准 抑菌圈直径判定标准阿莫西林 氯霉素 利福平 四环素 头孢噻吩 庆大霉素 青霉素 氟苯尼考 敏感；中度敏感；耐药。环素、头孢噻吩、庆大霉素、青霉素、氟苯尼考种抗生素均表现 中 高 度 敏 感，未 见 耐 药 性，与 刘 禹 辰 等、等 认为乳酸菌及其制剂有望作为抗生素的潜在候选替代物的观点一致。发酵液抑菌谱由表可知，细菌素粗提物对真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有抑菌活性。对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气假单胞菌、副溶血性弧菌、荧光假单胞菌、白色念珠菌、马红球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希氏菌种表 细菌素粗提物抑菌谱 指示菌株 细菌素粗提物抑菌圈直径效果 培养基沉淀复溶物抑菌圈直径效果白色念珠菌 马红球菌 单增李斯特氏菌 蜡样芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 阪崎肠杆菌 大肠埃希氏菌 鼠伤寒沙门氏菌 溶藻弧菌 哈维氏弧菌 嗜水气假单胞菌 副溶血性弧菌 荧光假单胞菌 “”表示抑菌圈直径为 ；“”表示抑菌圈直径 为 ；“”表 示 抑 菌 圈 直 径 为 ；“”表示未检出抑菌圈。基础研究 总第 期 年月致病菌抑菌圈直径均达 以上，呈现尤其良好的抑菌活性，对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、大肠埃希氏菌种食品致病菌亦呈现良好抑菌活性，具有广谱抑菌潜力。结论以副溶血性弧菌为指示菌，从环境中筛选出了株排除酸性 产 物 干 扰 后 仍具 抑 菌 活性 的 乳 酸 菌 菌 株，对 生物学特性进行深入研究，发现其生长活力高，产酸旺盛，对人工模拟胃肠液及高盐的苛刻环境具有良好耐受能力，对常见的种抗生素均无耐药性，其细菌素粗提物具有广谱抑菌潜力，对 种食品致病菌均呈现良好抑菌活性，有成为食品致病菌防控领域绿色、安全出发菌株的优良潜力，应用前景广阔。此外，可通过 蛋白鉴定进一步挖掘 细菌素粗提物的有效抑菌成分，可结合免疫组学和蛋白组学进一步阐明其抑菌机制。参考文献?焦辛妮?韦贤瑞?陈坚磊?等?一起副溶血性弧菌引起的食源性疾病暴发调查?实用预防医学?（?）?（?）?王霄晔?任婧寰?王哲?等?年全国食物中毒事件流行特征分析?疾病监测?（?）?（?）?李红秋?郭云昌?宋壮志?等?年中国大陆食源性疾病暴发监测资料分析?中国食品卫生杂志?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?李理?余腾斐?周晴晴?等?零乳糖乳酸菌发酵菌种的筛选及应用研究?中国乳品工业?（?）?（?）?章检明?步雨珊?杨慧?等?产抗菌肽乳酸菌筛选及抗菌肽的分离纯化与特性研究?食品安全质量检测学报?（?）?（?）?冯艳琴?万夕和?沈辉?等?水产动物副溶血性弧菌的拮抗菌研究进展?微生物学杂志?（?）?（?）?杨小慧?白酒窖池中益生性乳酸菌的分离筛选及其胞外多糖生物活性研究?呼和浩特?内蒙古大学?，于晨等：抑制副溶血性弧菌的乳酸菌筛选鉴定及其生物学特性研究?吴惠贞?罗伊氏乳杆菌发酵制备抑菌物质及其特性研究?广州?华南理工大学?吕蕾?杨晓萍?王阿利?等?酱油渣中具有抑菌活性的乳酸菌的筛选及其抑菌特性?食品工业科技?（?）?（?）?佳木泰?林晓龙?吴敬?等?副干酪乳酸杆菌所产抑菌物质的特性研究?中国乳品工业?（?）?（?）?杨慧?郭慧?郝红伟?等?副干酪乳杆菌?发酵乳对型糖尿病人群血糖的影响?食品科技?（?）?（?）?黄桂东?唐素婷?程云辉?等?酱油渣中乳酸乳球菌分离鉴定及对模拟胃肠环境的耐受性?食品与机械?（?）?（?）?余萍?曹蓝?矫艳平?等?副干酪乳杆菌?的筛选鉴定及其益生特性?食品与机械?（?）?（?）?刘禹辰?程雪?邓见文?等?益生菌在家禽生产中的应用及影响因素研究进展?中国家禽?（?）?（?）?（?）?（?）?（上接第 页）?冼学权?黎演明?杨辉?等?凝沉型及交联型淀粉微球的水包水乳液法制备及理化特性比较研究?河南工业大学学报?（?）?（?）?张昆明?陆小菊?黄永春?等?文丘里管空化强化壳聚糖抗菌纳米微球的制备研究?保鲜与加工?（?）?（?）?李海?张文康?冉力通?等?木薯淀粉微球的制备工艺研究?广西科技大学学报?（?）?（?）?丁涌波?和?基纳米抗性淀粉的制备技术及其结构和功能性质研究?重庆?西南大学?朱鹏?李新华?张博?等?交联淀粉微球的合成与表征?农业机械?（?）?（?）?（?）?（?）?基础研究 总第 期 年月