二十三、重组DNA技术基因工程的相关技术基因工程主要的工具酶基因克隆的质粒载体重组DNA的基本步骤基因工程的应用及其成果简介遗传工程的风险和伦理学问题（一）基因工程的相关技术1.核酸的分子杂交（1）DNA的变性与复性变性（熔解）：破坏DNA双链的氢键复性：DNA恢复双螺旋结构杂交：不同来源的互补核酸序列的缔合过程DNA/DNARNA/RNADNA/RNA（2）分子探针寻找特定基因探针：纯一、单链标记方法：放射性同位素标记地高辛标记（3）Southern印迹检测特定的DNA序列（4）Northern印迹检测细胞中活性基因转录的mRNA（5）原位杂交检测完整细胞中的核酸系列，确定具有不同类型细胞的组织中特定mRNA在单个细胞中表达情况。原位杂交法筛选DNA重组体图解复印至硝酸纤维素膜上用NaOH菌体裂解DNA变性杂交放射自显影32P-cDNA与放射性cDNA杂交的菌落的斑点细菌菌落单链DNA结合到膜上原位杂交2.聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction—PCR）►特点：活体外进行￭只需很少量￭DNA作为模板简便、快速取得大量的￭DNA片断（1）PCR技术的基本原理高温变性→低温退火→适温延伸PCR技术原理示意图靶序列变性和引物复性循环1循环2循环3变性和引物复性链延伸Tag酶链延伸（2）TaqDNA聚合酶耐高温（最适温度为720C）（3）寡核苷酸引物与待扩增的靶DNA区段两端序列互补人工合成的寡核苷酸短片段（15~30bp）（4）PCR技术的应用DNA分子很稳定（可保存几千—几万年）生物进化古生物学古人类学法医学（亲子、嫌疑犯鉴定）DNA测序制备分子探针（二）基因工程主要的工具酶1.限制性内切核酸酶是一类在特定的DNA位点切断DNA的酶。又称限制酶或限制性内切酶现已发现和鉴定出200多种可分Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，用途最广的是Ⅱ型酶。两种切割方式：粘性末端平齐末端2.DNA连接酶及其连接作用DNA连接酶有两种：（1）大肠杆菌DNA连接酶。只能连接粘性末端。较少用。（2）噬菌体T4DNA连接酶。可连接粘性末端和平齐末端。3.反转录酶能以DNA或RNA为模板合成DNA链。（三）基因克隆的质粒载体克隆载体：质粒噬菌体病毒1.质粒（plasmid）作为高质量克隆载体的质粒必须具有如下特性：（1）具有复制起点（2）携带易于筛选的选择标记（3）具有多种限制酶的单一识别位点（4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数（5）有安全性2.质粒载体pBR322质粒载体pBR322（p—plasmid；B—Bolivar（研究者）；R—Rogigerus（研究者）；322—实验编号）的优点：（1）相对分子质量较小（4361bp）（2）带有一个复制起...
