具有抗凝血和降血压活性的多靶点蛇毒蛋白研究.pdf

申请代码 B0104 受理部门 收件日期 受理编号 国家自然科学基金国家自然科学基金 申申 请请 书书 (2 0 1(2 0 1 1 1 版版)资助类别：面上项目 亚类说明：附注说明：项目名称：具有抗凝血和降血压活性的多靶点蛇毒蛋白研究 申 请 人：徐小龙 电话：0551-3603214 依托单位：中国科学技术大学 通讯地址：合肥市 金寨路 96 号 邮政编码：230026 单位电话：0551-3601957 电子邮箱： 申报日期：2011年2月28日 国家自然科学基金委员会 21171446 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 2 页 版本 1.003.136 基本信息基本信息 71gtnN0L9DH 申申 请请 人人 信信 息息 姓名 徐小龙 性别 男 出生 年月 1964 年 12 月 民 族 汉族 学位 博士 职称 副教授 每年工作时间（月）10 电话 0551-3603214 电子邮箱 传真 0551-3603388 国别或地区 中国 个 人 通 讯 地 址 合肥市 金寨路 96 号 工作单位 中国科学技术大学/化学系 主 要 研 究 领 域 生物无机化学、蛋白质化学 依托单位信息依托单位信息 名称 中国科学技术大学 联系人 赵乌兰 电子邮箱 电话 0551-3601957 网站地址 http:/ 合作研究单位信息合作研究单位信息 单 位 名 称 项项 目目 基基 本本 信信 息息 项目名称 具有抗凝血和降血压活性的多靶点蛇毒蛋白研究 资助类别 面上项目 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 B0104:生物无机化学 基地类别 研究期限 2012 年 1 月 2015 年 12 月 研究属性 基础研究 申请经费 70.0000 万元 摘摘 要要 (限限 400400 字字)：我们发现蛇毒中抗凝血因子 II（ACF II）是一个独特的多靶点作用蛋白：它既结合血液中凝血因子 IX 又结合血液中凝血因子 X，具有显著抗凝血活性；它还通过一氧化氮（NO）信号途径诱导血管舒张使血压下降。在凝血因子 IX 和凝血因子 X 结合蛋白家族中，只有 ACF II 具有抗凝血和降血压双重活性。本课题拟用亲和层析技术，以 ACF II 为诱饵蛋白找出 ACF II 降压作用目标靶蛋白，研究 ACF II 与新靶蛋白之间结合特性和金属离子在ACF II 多功能作用中所起的无机生物效应，分析 ACF II 结构与其功能多样性之间关系，研究 ACF II 抗肿瘤迁移活性，并通过 ACF II 诱导血管舒张反应这一理想实验系统，探索 ACF II对 NO 信号调节作用以及血液中信号分子和金属离子在 NO 信号传导中作用，重点在分子水平上阐明 ACF II 降压作用机理以及金属离子与其功能多样性之间关系，为治疗心脑血管疾病和癌症等药物设计提供基础。关关 键键 词词(用分号分开，最多 5 个)蛇毒；抗凝血因子 II；凝血因子 IX/凝血因子 X 结合蛋白；降血压活性；多靶点蛋白 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 3 页 版本 1.003.136 项目组主要项目组主要参与者参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮箱 项目分工 每年工作时间（月）1 沈登科 1984-7-15 男 博士生 学士 中国科学技术大学 0551-3603214 降压活性机理研究 10 2 刘毅 1980-7-6 男 博士生 学士 中国科学技术大学 0551-3603214 L 金属离子作用研究 10 3 吴斌 1980-06-26 男 博士生 学士 中国科学技术大学 0551-3603214 蛋白质定点突变研究 10 4 彭莉莉 1983-11-4 女 硕士生 学士 中国科学技术大学 0551-3603214 抗肿瘤活性研究 10 5 张燕 1985-1-15 女 硕士生 学士 中国科学技术大学 0551-3603214 蛋白质化学修饰研究 10 6 宋佳佳 1988-07-15 女 硕士生 学士 中国科学技术大学 0551-3603214 对 NO 信号调节研究 10 7 郭明春 1986-10-20 女 硕士生 学士 中国科学技术大学 0551-3603214 蛋白之间结合反应研究 10 8 晏新程 1986-10-23 男 硕士生 学士 中国科学技术大学 0551-3603214 降压活性目标蛋白研究 10 9 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 9 1 3 5 说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申请人），总人数由各分项自动加和产生。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 4 页 版本 1.003.136 经费申请表经费申请表 （金额单位：万元）科目 申请经费 备注（计算依据与说明）一一.研究经费研究经费 51.5000 1.科研业务费 24.5000 （1）测试/计算/分析费 14.0000 用于 SPR、ITC、LC-MS、EPS、CD、IR、荧光光谱等多种大型仪器测试（2）能源/动力费 3.0000 水电费（3）会议费/差旅费 2.0000 参加学术会议、科研交流（4）出版物/文献/信息传播费 3.5000 审稿费、发表费、申请专利费（5）其他 2.0000 2.实验材料费 21.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 16.0000 蛇毒、多种层析凝胶、易耗器材、生化试剂、化学试剂（2）其他 5.0000 生物化学试验、细胞培养试验、动物试验 3.仪器设备费 4.0000 （1）购置 4.0000 Mono Q 层析柱、Resource 层析柱、梯度仪、部分收集器、电脑配件/软件 （2）试制 4.实验室改装费 2.0000 实验室改装 5.协作费 二二.国际合作与交流费国际合作与交流费 5.0000 1.项目组成员出国合作交流 2.5000 参加重要的国际学术会议、出国交流 2.境外专家来华合作交流 2.5000 拟邀请日本明治药科大学 Takashi Morita 教授等专家来访 三三.劳务费劳务费 10.0000 用于直接参加项目研究的研究生、博士后人员的劳务费用 四四.管理费管理费 3.5000 5%合合 计计 70.0000 与本项目相关的 其他经费来源 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计其他经费来源合计 0.0000 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 5 页 申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求：1、请先选定项目基本信息中的资助类别，再填写报告正文；2、在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮，通过复制/粘贴恢复）；3、请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处；4、本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据，请遵照要求填写。报告正文报告正文面上项目申请书撰写提纲面上项目申请书撰写提纲 （一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1.项目的立项依据项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）蛇毒作为天然药物有着悠久的研究历史1，近来蛇毒抗血栓蛋白的研究取得了很大进展。1989 年，日本 Atoda 研究组首次从黄绿烙铁头蛇毒中分离出凝血因子 IX/凝血因子 X结合蛋白(Coagulation factor IX/factor X-binding protein,IX/X-bp)2，随后人们先后从蝰科蛇毒中分离出近十个具有类似性质的蛋白质3,4。它们具有很高的序列同源性和相似的晶体结构5,6，都是通过与血液中凝血因子 IX或凝血因子 X的结合来抑制凝血反应，所有的结合反应都依赖于 Ca2+、Mg2+等离子。凝血因子 IX/X 结合蛋白能有效阻断凝血酶原的激活，可以预防血栓的形成7。这类蛋白质作为一种天然的高效抗凝血药物，已引起国内外学者的极大兴趣8。尖吻蝮蛇俗称五步蛇，是我国境内一种重要的有药用和经济价值的毒蛇。我们从该蛇毒中分离出多种活性蛋白质，其中抗血小板凝集素既能降解纤维蛋白原，又能抑制血小板的凝集9，可治疗心脑血管疾病，该药已由合肥兆峰科大药业公司正式生产，并在临床上取得了很好的疗效。2000年，我们从该蛇毒中分离出两个抗凝血蛋白：抗凝血因子 I(Anticoagulation factor I,ACF I)和抗凝血因子 II(Anticoagulation factor II,ACF II)10。我们发现，ACF I 和 ACF II 都是凝血因子 X（FX）结合蛋白。在 Ca2+作用下，它们均与 FX形成 1:1 的复合物11,12，因而具有显著的抗凝血活性。ACF I 和 ACF II 具有 96.4%的序列同源性和十分相似的晶体结构（PDB code:1WT9 和 1Y17）。ACF I 和 ACF II 分 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 6 页 释放 激活 激活 激活 血管舒张 催化 催化 子中都含有两个 Ca2+结合位点，Ca2+不仅增加 ACF I 和 ACF II 的结构稳定性，而且能诱导去折叠的 ACF I 和 ACF II 重新折叠成天然结构12-14。近期我们发现，ACF I 和和 ACF II在在 Ca2+或或 Mg2+作用下也可以与凝血因子作用下也可以与凝血因子 IX（FIX）结合，这样）结合，这样 FIX 和和 FX 都是都是 ACF I和和 ACF II 的目标靶蛋白的目标靶蛋白。ACF I 和和 ACF II 无论结合无论结合 FIX 还是结合还是结合 FX，都能有效抑制都能有效抑制凝血反应，凝血反应，因此因此 ACF I 和和 ACF II 都是双靶点高效抗凝剂。都是双靶点高效抗凝剂。最近，我们研究了 ACF I 和 ACF II 对老鼠血液循环系统的影响。有趣的是，我们有趣的是，我们发现发现 ACF II 具有显著的快速降压活性具有显著的快速降压活性15。静脉滴注。静脉滴注 0.5 mg/kg ACF II 能在三十秒后导能在三十秒后导致致老鼠的动脉收缩压和舒张压分别下降老鼠的动脉收缩压和舒张压分别下降 35%和和 38%，而对老鼠的心率不产生影响。体，而对老鼠的心率不产生影响。体外实验结果表明，外实验结果表明，1 M ACF II 能引起老鼠动脉血管明显舒张。血管内腔有一薄层内皮能引起老鼠动脉血管明显舒张。血管内腔有一薄层内皮细胞，细胞，ACF II 不能舒张预先去掉内皮细胞的血管，表明不能舒张预先去掉内皮细胞的血管，表明 ACF II 的舒张血管活性依赖于的舒张血管活性依赖于血管内皮细胞。血管内皮细胞。血管内皮细胞中含有一氧化氮（NO）合成酶（endothelial NO synthase,eNOS）16，该酶将 L-精氨酸转化为瓜氨酸，同时释放出 NO（见图 1）17。NO是信号分子，它通过图 1中信号传导途径诱导血管平滑肌松弛使血管舒张。L硝基精氨酸甲酯（L-NAME）是 NO合成酶的抑制剂18。在体外，在体外，L-NAME 能显著抑制能显著抑制 ACF II 的舒张的舒张血管活性；在体内，血管活性；在体内，L-NAME 能显著抑制能显著抑制 ACF II 的降压活性。由此可知，的降压活性。由此可知，ACF II 通过通过NO 信号途径（信号途径（NO pathway）作用于血液循环系统。）作用于血液循环系统。ACF II 通过直接或间接的途径促通过直接或间接的途径促进血管内皮细胞中进血管内皮细胞中 NO 合成酶合成合成酶合成 NO，而，而 NO 诱导血管平滑肌松弛使血管舒张，从而诱导血管平滑肌松弛使血管舒张，从而导致血压下降。因此，导致血压下降。因此，ACF II 是是 NO 信号调节蛋白。信号调节蛋白。尽管尽管 ACF I 和和 ACF II 具有具有 96.4%的序列同源性和十分相似的晶体结构，但的序列同源性和十分相似的晶体结构，但 ACF I 没有任何降压活性没有任何降压活性。L-精氨酸 信号分子 内质网 Ca2+钙调蛋白 NO合成酶 GTP 鸟苷酸环化酶 NO 瓜氨酸 蛋白激酶 G 环鸟嘌呤核苷一磷酸 图图 1.导致血管舒张的信号传导途径 在测定血管舒张的离体实验中，先将老鼠动脉血管取出并清洗掉血管内外的血液，再将血管放入营养液中。凝血因子 IX（FIX）和凝血因子 X（FX）存在于血液中，而离体实验的营养液中没有 FIX和 FX。由此可见，ACF II 不是通过与不是通过与 FIX 或或 FX 结合来诱结合来诱导血管舒张，而是作用于血管内新的靶点导致血管舒张。因此，导血管舒张，而是作用于血管内新的靶点导致血管舒张。因此，ACF II 是多靶点作用蛋是多靶点作用蛋白，具有显著的抗凝血和降血压双重活性，对于治疗和预防心脑血管疾病具有广阔的应白，具有显著的抗凝血和降血压双重活性，对于治疗和预防心脑血管疾病具有广阔的应激活 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 7 页 用前景。用前景。Falanga 等人发现恶性肿瘤细胞在血液迁移中能非正常地聚集 FX19，而 FX促使附近的纤维蛋白原凝结成纤维蛋白，在肿瘤细胞表面产生纤维蛋白保护层。纤维蛋白是患者体内正常蛋白，不能被自身免疫系统识别。正是这种保护作用使肿瘤细胞能够躲避免疫系统的识别，实现在血液中迁移。ACF II 是 FX的高效抑制剂，我们由此推测它可能具有抑制恶性肿瘤迁移的作用。癌症和心脑血管疾病，是目前世界上最主要的致死因素，正严重威胁人类的健康。ACF II 可作为抗凝降压药物和潜在的抗肿瘤药物以及此类药物设计的模型，因此对它的进一步研究具有十分重要的医学价值。NO 信号分子不仅能调节血压，而且作用于造血细胞18、神经细胞20 和干细胞21,22。最近一篇 Nature文章报道23，NO 信号在中风和糖尿病患者氧化应激反应中发挥重要的调控作用。另外，NO信号在老年痴呆症发病过程中也起重要作用24。ACF II 诱导血管舒张反应可作为一个诱导血管舒张反应可作为一个理想的实验系统，利用该实验系统，可以研究理想的实验系统，利用该实验系统，可以研究 ACF II 对对 NO 信号的调节作用以及血液信号的调节作用以及血液中信号分子和金属离子在中信号分子和金属离子在 NO 信号传导中作用，以便进一步认识信号传导中作用，以便进一步认识 NO 信号传导的复杂作信号传导的复杂作用机制。用机制。鉴于 ACF II 是一个独特的多功能蛋白且具有多种潜在的用途，因此对 ACF II研究同时具有十分重要的科学意义。目前我们还不清楚 ACF II 降压作用的目标靶点。ACF II 降压活性依赖于血管内皮细胞，说明 ACF II 降压活性的作用靶点位于内皮细胞中。从 ACF II 快速降压作用推测，ACF II 作用靶点可能是蛋白质，而不可能是 DNA。从导致血管舒张的信号传导途径（见图 1）推测，参与信号传导的 NO 合成酶、钙调蛋白等都有可能是 ACF II 降压活性的目标靶蛋白。ACF I 和 ACF II 具有 96.4%的序列同源性和十分相似的空间结构，为什么ACF I没有降压活性而ACF II具有显著的降压活性？ACF II的降压活性是否依赖于金属离子？ACF II 是否具有抗肿瘤迁移作用？ACF II 功能多样性与其结构之间有怎样的关系？这些方面的研究至今未见报道。这些重要的问题都值得深入研究。本课题拟本课题拟用亲和层析技用亲和层析技术术，以，以ACF II为诱饵蛋白找出为诱饵蛋白找出ACF II降压活性的作用靶点降压活性的作用靶点，检测检测ACF II诱导诱导的的内皮细胞中内皮细胞中NO释放，释放，研究研究ACF II的降压作用机理以及金属离子在的降压作用机理以及金属离子在ACF II的的多种活性中所起的具体作用，研究多种活性中所起的具体作用，研究ACF II可能具有的抗肿瘤迁移活性，可能具有的抗肿瘤迁移活性，分析分析ACF II结构与其结构与其功能多样性之间关系功能多样性之间关系，通过，通过ACF II诱导血管舒张反应这一理想的实验系诱导血管舒张反应这一理想的实验系统，统，探索探索ACF II对对NO信号信号传导传导的调节作用以及血液中信号分子和金属离子在的调节作用以及血液中信号分子和金属离子在NO信号传信号传导中作用。导中作用。本项目的研究成功不仅能在分子水平上揭示ACF II独特的多功能作用机理，而且能阐明金属离子在ACF II的抗凝降压活性中所起的无机生物效应，并且为使ACF II尽快成为高效的抗凝降压药物进入临床应用提供基础。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 8 页 参考文献：参考文献：1.Koh DCI,Armugam A,Jeyaseelan K.Snake venom components and their applications in biomedicine.Cell.Mol.Life Sci.,2006,63,3030-3041.2.Atoda H,Morita T.A novel blood coagulation factor IX/factor X-binding protein with anticoagulant activity from the venom of Trimeresurus flavoviridis(habu snake):isolation and characterization.J.Biochem.,1989,106,808-813.3.Gopinath SC,Shikamoto Y,Mizuno H,et al.Snake-venom-derived factor IX-binding protein specifically blocks the gamma-carboxyglutamic acid-rich-domain-mediated membrane binding of human factors IX and X.Biochem.J.,2007,405,351-357.4.Ishikawa M,Kumashiro M,Yamazaki Y,et al.Anticoagulant mechanism of factor IX/factor X-binding protein isolated from the venom of Trimeresurus flavoviridis.J.Biochem.,2009,145,123-128.5.Mizuno H,Fujimoto Z,Atoda H,et al.Crystal structure of an anticoagulant protein in complex with the Gla domain of factor X.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2001,98,7230-7234.6.Suzuki N,Fujimoto Z,Morita T,et al.pH-dependent structural changes at Ca(II)-binding sites of coagulation factor IX-binding protein.J.Mol.Biol.,2005,353,80-87.7.Yamazaki Y,Morita T.Snake venom components affecting blood coagulation and the vascular system:Structural similarities and marked diversity.Curr.Pharm.Design,2007,13,2872-2886.8.Lee WH,Zhuang QY,Zhang Y.Cloning and characterization of a blood coagulation factor IX-binding protein from the venom of Trimeresurus stejnegeri.Toxicon,2003,41,765772.9.Xu XL,Chen JX,Zhang LY,et al.Calcium ion-induced stabilization and refolding of agkisacutacin from Agkistrodon acutus venom studied by fluorescent spectroscopy.J.Fluoresc.,2007,17,215-221.10.Xu XL,Liu QL,Xie YS,et al.Purification and characterization of anticoagulation factors from the venom of Agkistrodon acutus.Toxicon,2000,38,1517-1528.11.Xu XL,Zhang LY,Shen DK,et al.Effect of metal ion substitutions in anticoagulation factor I from the venom of Agkistrodon acutus on the binding of activated coagulation factor X and on structural stability.J.Biol.Inorg.Chem.,2009,14,559-571.12.Xu XL,Liu QL,Xie YS.Metal ion-induced stabilization and refolding of anticoagulation factor II from the venom of Agkistrodon acutus.Biochemistry,2002,41,3546-3554.13.Xu XL,Liu QL,Yu HM,et al.Ca(II)and Tb(III)-induced stabilization and refolding of anticoagulation factor I from the venom of Agkistrodon acutus.Protein.Sci.,2002,11,944-956.14.Shen DK,Xu XL,Wu H,et al.Metal ion binding to anticoagulation factor II from the venom of Agkistrodon acutus:stabilization of the structure and regulation of the binding affinity to activated coagulation factor X.J.Biol.Inorg.Chem.,2011,DOI 10.1007/s00775-010-0752-9.15.Shen DK,Xu XL,Zhang LY,et al.Identification of a nitric oxide-dependent hypotensive effect of anticoagulation factor II from the venom of Agkistrodon acutus.Biochem.Pharmacol.,2010,79,498-506.国家自然科学基金申请书 2011 版 第 9 页 16.Thibeault S,Rautureau Y,Oubaha M,et al.S-nitrosylation of beta-catenin by eNOS-derived NO promotes VEGF-induced endothelial cell permeability.Mol.Cell,2010,39,468-476.17.Roy B,Halvey EJ,Garthwaite J,et al.An enzyme-linked receptor mechanism for nitric oxide-activated guanylyl cyclase.J.Biol.Chem.,2008,283,18841-18851.18.Adamo L,Naveiras O,Wenzel PL.Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis.Nature,2009,459,1131-1135.19.Falanga A,Gordon SG.Isolation and characterization of cancer procoagulant:a cysteine proteinase from malignant tissue.Biochemistry,1985,24:5558-5567.20.Nott A,Watson PM,Robinson JD,et al.S-nitrosylation of histone deacetylase 2 induces chromatin remodelling in neurons.Nature,2008,455,411-415.21.North TE,Goessling W,Peeters M,et al.Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.Cell,2009,137,736-748.22.Pardanaud L,Eichmann A.The stress of forming blood cells.Nature,2009,459,1068-1069.23.Chen CA,Wang TY,Varadharaj S,et al.S-glutathionylation uncouples eNOS and regulates its cellular and vascular function.Nature,2010,468,1115-1118.24.Cho DH,Nakamura T,Fang JG,et al.S-nitrosylation of drp1 mediates beta-amyloid-related mitochondrial fission and neuronal injury.Science,2009,324,102-105.2.项目的研究内容、研究目标项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）研究内容研究内容：（1）从尖吻蝮蛇毒中纯化 ACF II，在体外通过细胞毒性实验和细胞凋亡实验研究 ACF II 的抗肿瘤活性；在体内以荷瘤老鼠为模型做动物实验，研究 ACF II 对肿瘤迁移活性的影响。（2）在体外培养老鼠血管内皮细胞，用 NO荧光探针（DAF-FM DA）检测 ACF II 诱导的内皮细胞中 NO释放，利用 pull-down技术，用共价偶联 ACF II（诱饵蛋白）的亲和层析柱分离纯化老鼠血管内皮细胞中与 ACF II 相结合的降压作用靶点，用液相色谱质谱联用仪对新靶蛋白进行鉴定，用表面等离子共振技术（SPR）和等温滴定量热法（ITC）定量研究 ACF II 与新靶蛋白结合反应的热力学和动力学性质以及金属离子在该结合反应中是否存在调节作用，用圆二色谱、荧光光谱、红外光谱、拉曼光谱、核磁共振谱等方法研究金属离子对新靶蛋白结构和性质的影响。如果新靶点是未知蛋白，初步研究新靶点的结构、性质与功能。（3）在 ACF I 和 ACF II 的氨基酸序列中，只有九个氨基酸残基不相同。这九个不相 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 10 页 同的氨基酸残基是造成 ACF I 和 ACF II 活性不同的内在原因。用化学修饰和定点突变等方法确定出在这九个氨基酸残基中哪几个氨基酸残基与 ACF II 降压活性有关，分析 ACF II 结构与其功能多样性之间关系。（4）通过 ACF II 诱导血管舒张反应这一理想的实验系统，研究 ACF II 对 NO信号传导的调节作用以及血液中信号分子（如：雌激素、雄激素、多肽类激素、氨基酸衍生物类激素等）和金属离子（如：Ca2+，Mg2+，Zn2+等）在 NO信号传导中作用。研究目标：研究目标：（1）在分子水平上阐明 ACF II 降压活性机理，搞清 ACF II 降压活性的作用靶点、ACF II 与新靶点结合反应的热力学和动力学性质以及金属离子在该结合反应中是否存在调节作用，确定出 ACF II 分子中起关键降压作用的氨基酸残基。（2）搞清 ACF II 对 NO 信号传导的调节作用，进一步了解血液中信号分子和金属离子在 NO信号传导中作用。（3）确定出 ACF II 是否具有抗肿瘤活性。拟解决的关键问题：拟解决的关键问题：（1）ACF II 降压活性的作用靶点。（2）ACF II 结构与其功能多样性之间关系。3.拟采取的研究方案及可行性分析。拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）研究方法和实验手段：研究方法和实验手段：(1)用现代层析分离方法从尖吻蝮蛇毒中纯化 ACF II，参考 Faouzi 和刘国红等人方法（J.Cell.Physiol.,2011,226,542-551;山东大学学报，医学版，2006,248-251），用 MTT 细胞增殖-毒性检测试剂盒(MTT Assay)测定 ACF II 对 Lewis 肺癌细胞毒性；用流式细胞仪检测ACF II诱导的Lewis肺癌细胞凋亡。参考Chen等人方法（Mol.Pharm.,2007,4,713-722），以 Lewis 肺癌老鼠腹水瘤为模型，测定 ACF II 对肿瘤迁移活性的影响。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 11 页 (2)参考Qiao和Cingoz 等人方法(Talanta,2009,80,98-103;J.Chromatogr.A,2008,1209,95-103)，将 ACF II 共价偶联到溴化氰预活化琼脂糖凝胶（CNBr-actived Sepharose 4B）上，制备亲和层析柱。参考 Sadanandam和张云香等人方法（Microvasc.Res.,2010,79,1-9;中国病理生理杂志，2008,24,60-63），在体外培养老鼠血管内皮细胞，用溶菌酶和超声波将老鼠血管内皮细胞裂解破碎，将细胞裂解液离心后取上清液，再利用经典的 pull-down 原理，以 ACF II 为诱饵蛋白，通过共价偶联 ACF II 的亲和层析柱分离上清液中与 ACF II 结合的靶蛋白。用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、电泳等方法测定靶蛋白的分子量。用胰蛋白酶（Trypin）水解靶蛋白，使之生成多个肽段，参考 Foettinger 等人方法（J.Ptoteme.Res.,2007,6,3827-3834），用液相色谱质谱联用仪（LC-MS）分析所得的酶解液以测定各个肽段的质量谱，将所得的质量谱进行老鼠蛋白质序列数据检索，可得出靶蛋白的部分序列信息，从而确定新靶蛋白是已知蛋白还是未知蛋白。再用 Western Blot方法进一步鉴定新靶蛋白。参考 Yip 等人方法(Brit.J.Pharmacol.,2009,156,1279-1286)，用 NO荧光探针(DAF-FM DA)检测 ACF II 诱导的内皮细胞中 NO释放。DAF-FM DA 是新一代 NO 荧光检测探针，它可以穿透细胞膜，因此利用DAF-FM DA可检测细胞内 NO释放。(3)参考 Kawamoto 等人方法（Biochemistry,2009,48,9534-9541），用表面等离子共振技术（SPR）测定 ACF II 与新靶蛋白结合反应的结合速度常数 kon、解离速度常数koff、结合平衡常数 Ka和解离平衡常数 Kd。参考 Lim等人方法(Biochemistry,2009,48,850-862)，用等温滴定量热法（ITC）测定 ACF II 与新靶蛋白结合反应的自由能变化G、焓变H、熵变S 等热力学性质。用 SPR 和 ITC方法测定金属离子对该结合反应的影响。用圆二色谱（CD）、荧光光谱、红外光谱、拉曼光谱、核磁共振谱（NMR）等方法研究金属离子对新靶蛋白结构和性质的影响。(4)参考 Prasad等人方法(Biometals,2009,22,711-721)，用乙氧基甲酸酐（DEPC）修饰 ACF II 分子中与 ACF I 不同源的组氨酸残基（His-56），分析这个组氨酸残基是否与其降压活性有关。参考 Hu 等人的克隆和表达 ACF I 方法（Toxicon,2005,716-724），将 ACF II 分子中九个与 ACF I 不同源的氨基酸残基逐个定点突变（也可从生物公司购买商品化的 ACF II 突变基因），再表达出 ACF II的突变蛋白，测定突变蛋白的降压活性，以确定哪几个氨基酸残基与 ACF II 降压活性有关。(5)参考 Hayashida 等人方法(Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.,2004,R356-R365)，取出老鼠动脉血管，建立 ACF II 诱导血管舒张反应的实验系统，并 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 12 页 通过这一理想的实验系统，研究 ACF II 对 NO信号的调节作用以及血液中信号分子和金属离子在 NO信号传导中作用。技术技术路线：路线：ACF II 的制备 ACF II 抗肿瘤活性研究 ACF II 降压活性研究 血管内皮细胞培养 ACF II 舒张血管活性研究 ACF II 诱导内皮细胞 NO释放检测 ACF II 与新靶蛋白结合反应研究 ACF II 降压活性目标蛋白研究 金属离子对新靶蛋白结构和功能影响 新靶蛋白结构、性质和功能研究 金属离子对 ACF II 与新靶蛋白结合反应影响研究 ACF II 化学修饰研究 ACF II 定点突变研究 ACF II 对 NO信号的调节作用研究 信号分子和金属离子在 NO信号传导中作用研究 关键技术及可行性分析：关键技术及可行性分析：(1)我们已熟练掌握了 ACF II 的分离纯化技术（Toxicon,2000,38,1517-1528）。我们也熟练掌握了化学修饰、圆二色谱、红外光谱、拉曼光谱、核磁共振谱等经典分析方法，并取得了许多研究蛋白质作用机理、蛋白结构与功能关系、金属离子活性中心结构和性质等方面的成功经验，这方面已发表多篇文章，如：J.Biol.Inorg.Chem.,2011,16,69-79;Biochem.Pharmacol.,2010,79,498-506；Mol.Biosyst.,2009,5,644-650；J.Fluoresc.,2008,18,193-201;Biopolymers,2006,82,167-175；国家自然科学基金申请书 2011 版 第 13 页 Biopolymers,2004,74,336-344；Protein Sci.,2002,11,944-956；Chem.Lett.,2002,3,354-355；Toxicon,2001,39,1359-1365等。(2)利用利用 pull-down 原理原理确定确定 ACF II 降压降压作用作用的的靶点靶点是本项目关键技术是本项目关键技术。我们已熟练掌握了 pull-down技术，目前已制备出共价偶联 ACF II 的亲和层析柱，通过共价偶联 ACF II 亲和层析柱和高效液相色谱的二步纯化成功地从猪血中纯化出高纯度的猪凝血因子 IX 和猪凝血因子 X，最近申请了一项高效制备 FIX 和 FX 的专利（专利号 201110001483.3）。血管内皮细胞可以