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生物学实骗技市手册VI.C4目录 1.基因组 DNA 提取.9 1.1.酵母、细菌基因组 DNA 提取.9 1.2.真核细胞 DNA 的制备与定量.9 1.3.DNA 片段回收与纯化-冻融法.11 1.4.琼脂糖凝胶的特点.11 1.5.琼脂糖核酸电泳.13 2.聚合酶链式反应（PCR）.14 2.1.PCR 概述.14 2.2.PCR 引物设计黄金法则.17 2.3.PCR 反应体系.18 2.4.PCR 反应的重要因素.19 2.5.PCR 反应条件的选择.20 2.6.PCR 常见问题总汇.22 2.7.减少 PCR 产物中引物二聚体的方法.23 2.8.pfu特性 FAQ.24 2.9.增加 PCR 特异性的方法.26 2.10.反向 PCR（染色体步移）.28 2.11.PCR 污染与对策.29 2.12.PCR 产物纯化方法（酚/氯仿）.32 2.13.大肠杆菌菌落 PCR.32 2.14.酵母菌落 PCR.33 2.15.胶回收纯化 DNA.33 2.16.PCR 技术片段拼接的 SOE 和 SDL 方法.34 2.17.SOE-PCR，Fusion-PCR FAQ.34 2.18.聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PCR-SSCP).39 2.19.用 Fusion PCR 构建基因片段.42 3.载体 DNA 的提取、鉴定与相关操作.43 3.1.质粒概述.43 3.2.质粒快速鉴定.45 3.3.质粒 DNA 的小量制备（20 l）.45 3.4.质粒 DNA 的大量制备（3 mL）.48 3.5.噬菌体 DNA 提取.49 3.6.酶切.50 3.7.单酶切.51 3.8.单酶切方向问题：注意！.52 3.9.双酶切.52 3.10.KpnI+BamHI.53 3.11.XbaI+BamHI.53 3.12.连接.54 3.13.酶切产物的乙醇沉淀方法.54 4.TA 克隆、亚克隆、克隆相关.55 4.1.目的基因的亚克隆.55 4.2.T4 DNA 连接酶 FAQ.57 4.3.PCR 产物的克隆.59 4.4.外源 DNA 和质粒载体的连接反应.60 54.5.克隆 PCR 产物 FAQ.62 4.6.连接反应心得.63 4.7.DNA 重组实验.65 4.8.pfu 的 PCR 产物加 A 尾巴以便于 T 载体连接及 pMD-18T 连接体系.67 5.感受态细胞的制备、转化及转化子的筛选与鉴定.68 5.1.大肠杆菌化学法感受态细胞的制备及转化.68 5.2.大肠杆菌化学法高效率感受态细胞的制备（详细的）.69 5.3.大肠杆菌电转化感受态细胞的制备及转化.70 5.4.重组子的筛选和鉴定.71 5.5.酵母电转化感受态细胞制备及转化.72 5.6.不带抗性的酵母营养缺陷型的富集与筛选.73 5.7.毕赤酵母电转化方法.73 5.8.电击杯处理.74 5.9.真核转染.75 5.10.PDS-1000 基因枪操作手册.77 6.基因敲除、定点突变，与定向进化.78 6.1.一种可重复利用的酵母基因敲除方法.78 6.2.自杀质粒.80 6.3.基于 DpnI 的定点突变方法.81 6.4.基于 PCR 的定点突变实例.82 7.核酸与蛋白质杂交技术.82 7.1.Southern 杂交（一）.82 7.2.Southern 杂交（二）.85 7.3.Northern 杂交（一）.86 7.4.Northern 杂交（二）.88 7.5.Western 杂交（一）.90 7.6.Western 杂交（二）.91 7.7.抗体制备技术的选择.95 7.8.原位杂交技术简介.98 7.9.原位杂交组织化学常用试剂及处理.102 7.10.荧光原位杂交（FISH）.114 8.酵母双杂交技术.116 8.1.酵母双杂交技术及其在蛋白质组研究中的应用.116 8.2.酵母双杂交系统的发展和应用.119 8.3.LexA 酵母双杂交系统操作方法.121 8.4.酵母双杂交系统的建立与发展.132 8.5.酵母双杂交系统研究及其应用.133 8.6.酵母双杂交实验 FAQ.136 9.RNA136 9.1.RNA 操作中的一般要求.136 9.2.蛋白酶 K 替代 DEPC 的系统方法.137 9.3.总 RNA 的提取（Trizol 法提取）.137 9.4.一种快速鉴定 RNA 质量的方法.137 9.5.组织和细胞 RNA 的制备.139 9.6.哺乳动物细胞总 RNA 的分离.140 9.7.mRNA 的分离与纯化.142 69.8.RNA 质量的确定.143 9.9.RNA 酶保护试验.143 9.10.mRNA 差别显示技术.145 9.11.RT-PCR 简介.149 9.12.RT-PCR 引物设计原则和方法.151 9.13.RT-PCR.152 9.14.RT-PCR 经验.153 9.15.荧光 PCR 原理.154 9.16.RNAi 实验原理与方法.155 9.17.RNAi 技术新突破：根据 SNP 选择性沉默突变基因.159 9.18.RNAi：制备 siRNAs 的方法.159 9.19.dsRNA 和 RNA 干扰技术.164 10.蛋白质异源表达、分离、纯化与鉴定.168 10.1.原核表达.168 10.2.原核表达的插入位点问题.169 10.3.工程菌发酵.170 10.4.细胞破碎.170 10.5.蛋白含量测定方法.170 10.6.包涵体复性.170 10.7.重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量.171 10.8.表达蛋白的 SDS-PAGE 电泳分析.171 10.9.选择材料及预处理.172 10.10.蛋白质的分离纯化.173 10.11.细胞的破碎.175 10.12.浓缩、干燥及保存.175 10.13.细菌蛋白质的透析体会.176 10.14.表达蛋白的分离与纯化.177 10.15.蛋白质提取方法例子.178 11.蛋白质组学.180 11.1.蛋白质组技术的研究进展.180 11.2.蛋白质组学及研究技术路线.184 11.3.电泳技术简介.186 11.4.等电聚焦电泳.190 11.5.双向电泳的样品的制备.192 11.6.双向电泳操作步骤.193 11.7.SDS-PAGE 胶染色.194 11.8.双向电泳蛋白点的切取和保存.195 11.9.数据库搜索(Databases search).195 11.10.主要的公共数据库及网址.196 11.11.双向电泳常见问题与原因.196 11.12.蛋白质的序列分析流程.197 11.13.聚丙烯酰胺凝胶的配制.198 11.14.双向电泳常用溶液配方.199 12.光滑球拟酵母相关参数测定.201 12.1.细胞干重.201 12.2.丙酮酸酶法测定方法.201 712.3.丙酮酸和-KG 浓度 HPLC 测定方法.202 13.微生物生理.202 13.1.细菌的生物化学试验.202 13.2.MTT 法实验原理与 MTT 溶液的配制方法.204 13.3.酵母菌分类.204 13.4.细胞凋亡的分子生物学检测方法.208 13.5.液体培养中细胞凋亡（PCD）过程的监测.209 14.哺乳动物细胞及动物实验.212 14.1.真核细胞的转染.212 14.2.转染细胞的稳定筛选.212 14.3.肿瘤细胞体外传代培养及保种.213 14.4.肿瘤动物模型的建立.213 14.5.小鼠尾静脉注射方法.213 14.6.肿瘤蛋白疫苗预防性动物实验.214 14.7.人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养.214 14.8.实验动物免疫方案.214 14.9.血清制备.215 14.10.ELISA.215 14.11.血清学筛选克隆新抗原/新基因.215 14.12.ELISPOT.217 14.13.藻酸盐包裹实验.217 14.14.重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作（细菌内同源重组 AdEasy System）.218 14.15.免疫组化染色.222 14.16.流式细胞仪常用的几种检测方法.224 14.17.人肿瘤抗原的识别与鉴定免疫沉淀实验流程.227 15.附录-试剂配方.227 15.1.常用贮液与溶液.228 15.2.温度对常用缓冲液 pH 的影响.248 15.3.pH 计的使用方法.248 15.4.电泳缓冲液、染料和凝胶加样液.250 15.5.常用溶剂与水的共沸物数据.253 15.6.不同温度下常见无机化合物的溶解度.254 15.7.实验室常用技术参数资料.262 15.8.常用酶的配制.264 15.9.杂交试验中用于降低背景的封闭剂.264 15.10.常用凝胶的技术参数.265 15.11.遗传密码表.267 15.12.常用酸碱技术参数.268 15.13.20 种标准氨基酸的命名及性质.269 15.14.常见的 E.coli End-和 End+菌.269 15.15.常用质粒和粘粒载体的复制起始点和拷贝数.270 15.16.麦氏浊度计标准管配制方法.270 15.17.常用培养基.270 15.18.常用缓冲溶液.302 15.19.常用抗生素.309 15.20.细胞化学和细胞组分分离溶液.311 815.21.细胞培养和细胞融合溶液.313 15.22.制备电镜标本的溶液.314 15.23.显影、定影溶液.315 15.24.微生物学实验常用染色液的配制.316 15.25.实验用水.319 15.26.各种核酸材料的贮存.323 15.27.分子生物学人员常用数据库.324 15.28.GeneBank 概览.328 15.29.分子生物学人员常用软件.335 15.30.分子生物学实验中的细节问题和小技巧.336 9 1.基因组 DNA 提取 1.1.酵母、细菌基因组 DNA 提取 11 ml 菌体发酵液，10000rpm 离心 10 min，去上清液；2加 500 uL TE 悬浮沉淀，并加 10-20 uL Lysozyme 混匀，37 度保温 0.5 h；3加 30 uL10%SDS，3 uL 20ug/ml（或 1 mg 干粉）蛋白酶 K，混匀，37 度保温 1 h；4加 100 ul 5 mol/L NaCl 混匀；5加 8 ul CTAB/NaCl 溶液，混匀，65 度保温 10 min；6用等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提，10000rpm 离心 5min，将上清液移至干净离心管中；7用等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提，10000rpm 离心 5 min，取上清液移至干净离心管中；8加等体积异丙醇，颠倒混合，-20 度静止 20 min，沉淀 DNA，10000rpm 离心 5min；9倒出上清液，DNA 沉淀用 70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于 50 uL TE；10最后贮存液中加入 1 uL RNase。结果 通常可获得 3-5ugDNA。讨论 1在培养箱温度不够稳定等因素的影响下，有时隔夜后没有菌落形成，此时不必急于怀疑实验失败。建议再倒置培养一些时候，比如等到中午，或更晚一些时候，培养皿上会出现菌落。2挑取菌落必须是单菌落，而不是那些融合的菌落。如果培养皿上的菌落全部融合，则建议重新划板培养，直至有单菌落为止。不然一旦混有不同的菌落，可能会给以后的实验带来麻烦。3有关微型离心柱回收的利弊。原理与本实验近似，区别在于在 DNA 的回收阶段，不是采用醋酸钠-乙醇沉淀，而是采用微型柱。回收产物中往往留有痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续工作困难。4离心要求平衡。方法是保证离心机转子对面两侧的试管孔内有含有相等数量的离心物和试管，使两侧平衡。如果仅有一个离心管，则要求对面放置另一根相同规格的离心管，管内加入与样品数量相等的水。5DNA 的离心通常采用 1.4 万转的转速，10 分钟的时间，这足以满足沉淀 DNA 的要求。6沉淀 DNA 或 RNA 离心时，应把 Eppendorf 管盖的连接蒂指向外侧，以保证离心后沉淀位于管底靠连接蒂的一侧，当 DNA 或 RNA 量少至难以辨认时，吸取上清之际，可避免吸头触及这一区域把所需沉淀吸起。7室温下，DNA 沉淀容易浮起，所以整个操作过程应保持在 4环境下进行，手指持试管上部，切勿接触试管底部。8吸取上清时动作要轻而快，加入 75乙醇时，应将乙醇沿管壁轻轻加入，以免将沉淀冲起。9通常，实验对 RNA 污染不是有严格要求的话，比如做酶切鉴定的话，实验步骤（加 TE、RNase、NaAC等）可以免去。这样可以提高实验速度。10离心后大肠杆菌的裂解物会黏附于管壁和浮于离心液表面，为避免大肠杆菌的裂解物堵塞吸头，可以一面将吸头推出气体，一面插入表面含有大肠杆菌的裂解物的离心液。11加入溶液 I 前，可用 200l 枪头将菌液吸干净。12加入溶液、后，应轻轻颠倒混匀，切忌剧烈震荡混匀，否则容易打断 DNA。13单纯乙醇沉淀效差，可考虑加醋酸钠等盐。加 75乙醇是为了清洗菌斑，若菌斑中还有无机盐，25的水可以把无机盐溶解出来，乙醇可把有机溶剂置换出来。1465水浴时要打开盖子，这样可以使乙醇等挥发掉。！：另各公司都提供原理类似的试剂盒。1.2.真核细胞 DNA 的制备与定量 10制备基因组 DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于 100-200kb。在DNA 提取过程中应尽量避免使 DNA 断裂和降解的各种因素，以保证 DNA 的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组 DNA 有 107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在 EDTA以及 SDS 等试剂存在下用蛋白酶 K 消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的 DNA 不仅经酶切后可用于Southern 分析，还可用于 PCR 的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的 DNA 提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制 DNase 对 DNA 的降解；（2）尽量减少对溶液中 DNA 的机械剪切破坏。一、试剂准备 1TE:10mM Tris-HCl(pH 7.8);1mM EDTA(pH 8.0)。2TBS:25mM Tris-HCl(pH 7.4);200mM NaCl;5mM KCl。3裂解缓冲液：250mM SDS;使用前加入蛋白酶 K 至 100g/ml。420%SDS 52mg/ml 蛋白酶 K 6Tris 饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚氯仿=11）、氯仿 7无水乙醇、75%乙醇 二、操作步骤（一）材料处理 1新鲜或冰冻组织处理：取组织块 0.3-0.5cm3，剪碎，加 TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。将匀浆液转移到 1.5ml 离心管中。加 20%SDS 25 l，蛋白酶 K(2mg/ml)25 l，混匀。60C 水浴 1-3hr。2培养细胞处理：将培养细胞悬浮后，用 TBS 洗涤一次。离心 4000g5min，去除上清液。加 10 倍体积的裂解缓冲液。50-55C 水浴 1-2hr。（二）DNA 提取 1.加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀 3min。2.离心 5000g10min，取上层水相到另一 1.5ml 离心管中。3.加等体积饱和酚，混匀，离心 5000g10min，取上层水相到另一管中。4.加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心 5000g10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5.加等体积氯仿，轻轻混匀，离心 5000g10min，取上层水相到另一管中。6.加 1/10 体积的 3M 醋酸钠（pH 5.2）和 2.5 倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7.待絮状物出现后，离心 5000g5min，弃上清液。8.沉淀用 75%乙醇洗涤，离心 5000g3min，弃上清液。9.室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加 50-100l TE 溶解过夜。（三）DNA 定量和电泳检测 1.DNA 定量：DNA 在 260nm 处有最大的吸收峰，蛋白质在 280nm 处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在 230nm 处。因此，可以用 260nm 波长进行分光测定 DNA 浓度，OD 值为 1 相当于大约 50g/ml 双链 DNA。如用 1cm 光径，用 H2O 稀释 DNA 样品 n 倍并以 H2O 为空白对照，根据此时读出的 OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50OD260读数稀释倍数/1000。DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在 0.4-0.5 之间，若比值较高说明有残余的盐存在。112.电泳检测：取 1g 基因组 DNA 用行 0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测 DNA 的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。三、注意事项 1.所有用品均需要高温高压，以灭活残余的 DNA 酶。2.所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3.用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断 DNA 的可能性。4.用上述方法提取的 DNA 纯度可以满足一般实验（如 Southern 杂交、PCR 等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行 DNA 纯化。1.3.DNA 片段回收与纯化-冻融法 质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR 产物经电泳后，常常需要对一些 DNA 电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA 回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。1.紫外灯下仔细切下含待回收 DNA 的胶条，将切下的胶条（小于 0.6 g）捣碎，置于 1.5 ml 离心管中；2.加入等体积的 Tris-HCl 饱和酚（pH 7.6），振荡混匀；3.-20放置 5-10 min；4.4离心 10000g5 min，上层液转移置另一离心管中；5.加入 1/4 体积 H2O 于含胶的离心管中，振荡混匀；6.-20，放置 5-10 min；7.4离心 10000g5 min，合并上清液；8.用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；9.加入 1/10 体积 3 M NaAc（pH 5.2）、2.5 倍体积预冷的无水乙醇，混匀；10.-20，静置 30 min；11.4离心 13000g10 min，弃上清，75%乙醇洗沉淀 1-2 次，晾干；12.加适量 H2O 或 TE 溶解沉淀。注意事项 紫外灯下切下含待回收 DNA 的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无 DNA 污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA 的污染。1.4.琼脂糖凝胶的特点 一、琼脂糖凝胶的特点 天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占 80%）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。（1）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。（2）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占 98%99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。（3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。（4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug 蛋白质就可检出。琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如 DNA 鉴定，DNA 限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。12二、DNA 的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系（1）DNA 分子的大小 在凝胶中，DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当 DNA 分子大小超过 20kb 时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离 DNA时，分子大小不宜超过此值。（2）琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的 DNA 需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度与 DNA 分离范围 琼脂糖浓度/%0.30.60.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状 DNA 大小/kb 60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型 DNA 的移动速度次序为：供价闭环 DNA（covalently closed circular，cccDNA）直线 DNA开环的双链环状 DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状 DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为 0（Rm=0），而同等大小的直线双链 DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。3、电泳方法（1）凝胶类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下 1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。（2）缓冲液系统 缺少离子时，电流太小，DNA 迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和 DNA 的变性。常用的电泳缓冲液有 EDTA（pH8.0）和 Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或 Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.57.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。TAE 缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE 浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存 5溶液，用时稀释 10 倍 0.5工作溶液即能提供足够缓冲能力。（3）凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。（4）样品配制与加样 DNA 样品用适量 Tris-EDTA 缓冲液溶解，缓冲液内含有 0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有 10%-15%蔗糖或5%10%甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生 U 形条带，可改用 2.5%Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。（5）电泳 琼脂糖凝胶分离大分子 DNA 实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性 DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的 DNA 片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离 DNA 片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于 DNA 在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于 0.5%时，为增加凝胶硬度，可在 4进行电泳。（6）染色和拍照 13 常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察 DNA 条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。三、印迹转移电泳 生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的 DNA 进行分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作，1975 年，Southren 创造了将 DNA 区带原位转移到硝酸基纤维素膜（NC 膜）上，再进行杂交的方法，被称为Southren 印迹法。随后，Alwine 等将类似方法用于 RNA 印迹，被戏称为 Northern 印迹，1979 年 Towbin 等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为Western 印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压高电流电泳完成转移。1982 年 Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上，称 Eastern 印迹。目前国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装置出售，使印迹转移速度快效率高、重复性好，应用更加广泛。聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹转移电泳，但转移蛋白质时，凝胶中不可含有 SDS、尿素等变性剂。用于转移电泳的支持膜亦有多种选择，近些年用尼龙膜较多，因为尼龙膜机械性能好，烘烤不变脆，使用时比硝酸纤维素膜更方便。进行印迹转移电泳时，要注意缓冲液的离子强度要低，pH 要远离 pI，使蛋白质带有较多电荷，一般用稳定性较好的 Tris-缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间有能有气泡。适当提高电压或电流可以提高转移速度，但亦会增加热效应，故电压或电流不可过高。四、交变脉冲电场凝胶电泳 一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于 20kb 的 DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA 分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使 DNA 变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大。如此时改变电场方向，则 DNA 分子必须改变其构象，沿新的泳动方面伸直，而转向时间与 DNA 分子大小关系极为密切。1983年 Schwartz 等人根据 DNA 分子弹性弛豫时间（外推为 0 的滞留时间）与 DNA 分子大小有关的特性，设计了脉冲电场梯度凝胶，交替采用两个垂直方向的不均匀电场，使 DNA 分子在凝胶中不断改变方向，从而使 DNA 按分子大小分开。后来 Carle 等改进了电泳技术，并发现周期性的反转换电场(periodic inversion of the electric field)亦能使大分子 DNA 通过电泳分开。电泳系统是由一水平式电泳槽和两组独立、彼此垂直的电极组成，一组电极负极为 N，正极为 S；另一组负极为 W，正极为 E。一块正方形琼脂糖凝胶板（10cm*10cm 或 20cm*20cm）呈 45 度放中央。电场在 N-S 和 W-E 之间交替建立。电场交替改变的时间长短与欲分离的 DNA 分子大小有关。电泳时，DNA 分子处在连续间隔交替的电场中。首先向 S 极移动，然后改向 E 极。在每次电场方向改变时，DNA 分子就要有一定的时间松弛，改变形状和迁移方向。只有当 DNA 分子达到一定构型后，才能继续前时。DNA 分子净移动方向与加样线垂直，使样品中各组分沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数百万碱基对的大分子 DNA。较新式的仪器电极间的角度和脉冲时间均可调，使用更加方便。此外，琼脂糖平板常用于免疫扩散技术的电泳技术相结合的多种免疫电泳 1.5.琼脂糖核酸电泳 1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2.根据欲分离 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般 2030 ml）；3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4.室温下 3045 分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面 1mm 为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6.在 DNA 样品中加入 10体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记 DNA 样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。一般 60100V 电压，电泳 2040min 即可；8.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；149.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准 Marker 比较被扩增产物的大小。琼脂糖凝胶浓度与线形 DNA 的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度 线形 DNA 的最佳分辨范围（bp）0.5%1,00030,000 0.7%80012,000 1.0%50010,000 1.2%4007,000 1.5%2003,000 2.0%502,000 2.聚合酶链式反应（PCR）2.1.PCR 概述 PCR 技术概论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的 DNA 供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用 PCR 几小时便可完成。PCR 技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。PCR 技术简史 PCR 的最早设想 核酸研究已有 100 多年的历史，本世纪 60 年代末、70 年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana 于 1971 年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过 DNA 变性，与合适的引物杂交，用 DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆 tRNA 基因”。PCR 的实现 1985 年美国 PE-Cetus 公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于 DNA 的体内复制，只是在试管中给 DNA 的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板 DNA，寡核苷酸引物，DNA 聚合酶，合适的缓冲体系，DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在 37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其 PCR 产物特异性较差，合成的 DNA 片段不均一。此种以 Klenow 酶催化的 PCR 技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow 酶不耐热，在 DNA 模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给 PCR 技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR 技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988 年初，Keohanog 改用 T4 DNA 聚合酶进行 PCR，其扩增的 DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种 DNA 片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988 年 Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热 DNA 聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在 70下反应 2h后其残留活性大于原来的 90%，在 93下反应 2h 后其残留活性是原来的 60%，在 95下反应 2h 后其残留活性是原来的 40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶 I Klenow 片段区别，将此酶命名为 Taq DNA 多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使 PCR 广泛的被应用。PCR 技术基本原理 PCR 技术的基本原理 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列 15为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR 的反应动力学 PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 Y(1X)n 计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示平(Y)均每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR 扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链 5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的 DNA 为模板，引物是从 3端开始延伸，其 5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的 5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段 3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得 PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检测用。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的 PCR 由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的 DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板 DNA 置高温下（通常为 93-94）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的 DNA 聚合酶（Taq 酶）在72将单核苷酸从引物的 3端开始掺入，以目的基因为模板从 53方向延伸，合成 DNA 的新互补链。PCR 能快速特异扩增任何已知目的基因或 DNA 片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始 DNA 混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性 DNA 片段。因此，PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和 DNA 分析中有