实验方法总结（1）：基因操作工具1、基因A（GeneA）的敲减载体构建...............................................................................12、GeneA过表达载体构建................................................................................................13、GeneA点突变载体构建................................................................................................14、GeneA敲除载体构建（CRISPR/Cas9法）..................................................................25、GeneA敲除载体构建（TALENs法）............................................................................26、GeneA的miRNA载体表达构建...................................................................................21、基因A（GeneA）的敲减载体构建版本1：针对GeneA，在Sigma网站上搜索已验证过敲减效率的shRNA序列，合成后两端加上酶切位点，合成双链DNAoligo，成为含干扰序列的具对应粘性末端的shRNA表达框架。以EcorI和BamHI内切酶酶切pEGFP载体以使其线性化，形成不对称的粘性末端。将shRNA表达框架插入pGP，转化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆行PCR鉴定与测序，构建含有针对GeneA的shRNA骨架质粒。版本2：从Genebank调取人GeneA核苷酸序列，利用Ambion数据库软件设计针对GeneA的有效的shRNA序列，经Blast比对进行同源性分析后，选出特异性较高的3组分别命名，以可以被任意替换的茎干发夹结构作为阴性对照。取pEGFPshRNA载体15μL于EP管，用BamHI1.5μL与EcoRII1.5μL、10×buffer5μL酶切反应4h以上；产物回收加入T4DNALigase使GeneAshRNA片段与目的载体连接，连接产物加入至DH5α感受态细胞中转化；用高纯质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，同时挑取阳性克隆行PCR鉴定、DNA测序。2、GeneA过表达载体构建从PubmedNucleotide数据库中检索针对目的基因的CDS序列，将序列导入DNAMAN软件中，进行酶切位点分析；在该序列中不包含的酶切位点中，选择克隆载体上多克隆位点中有的两个限制性内切酶——EcoRI和SacII。引物直接在GeneACDS编码区起始和末端设计，然后在引物的5’端加上相应的酶切位点。以cDNA为模板扩增目的基因片段，电泳胶回收目的片段后用其两端酶切位点处理片段并纯化回收。以同样的酶切位点处理pCDH载体以使其线性化，胶回收载体后与片段连接并转化DH5α感受态细胞，通过PCR鉴定阳性克隆并测...
