项目名称：基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法首席科学家：周德敏北京大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部一、研究内容1、拟解决的关键科学问题（1）利用酪氨酸、亮氨酸和吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶/tRNA正交对，以及大肠杆菌和酵母筛选系统，在蛋白质中特定位点引入特殊的非天然氨基酸，包括荧光氨基酸、具有生物正交化学反应性能的非天然氨基酸、高效率的光交联氨基酸、较大双光子吸收截面的光转化氨基酸、磷酸化的氨基酸、含有19F或自由基的氨基酸等。（2）针对已有筛选系统效率不高的问题，发展结构生物学和计算生物学的方法，为筛选体系建立理论指导。（3）发展和优化以“无铜点击化学”为代表的活体蛋白质特异正交标记技术。（4）发展和优化氟取代化学反应，以期在蛋白质中引入19F探针，并优化荧光标记基团的性能。（5）发展蛋白质特异标记方法，揭示哺乳动物细胞和线虫细胞的运动机理。（6）拓展蛋白质特异标记方法，发现药物新靶标，优化蛋白质药物的靶向性和半寿期。2、主要研究内容本项目的主要研究内容是以在蛋白质特定位点插入非天然氨基酸为主要研究手段，结合超高分辨率荧光成像、核磁和顺磁共振技术和结构生物学、蛋白质组学技术，深入研究细胞生物学和医药学研究中所涉及的重要科学问题。（1）基因编码非天然氨基酸筛选平台的构建通过人工进化的方法增加编码非天然氨基酸。首先把无义密码子“UAG”确定为新的遗传密码，进而对天然的转运核糖核酸（tRNA）基因突变,使其含有反密码子“CUA”。在此基础上从氨酰-tRNA合成酶突变库中，筛选出可专一结合这种tRNA和指定非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶突变体。然后再将生命体中mRNA上任意一个遗传密码取代为UAG,并在培养基中加入化学合成的非天然氨基酸，从而在蛋白质中的相应位置插入具有特殊物理或化学性质的非天然氨基酸。其简要技术路线见图1:图1：基因编码的非天然氨基酸的总体技术路线及正负循环筛选途径（2）真核细胞蛋白质翻译起始机制的解析eIF2α磷酸化作为蛋白质翻译起始的“总开关”，受到多种细胞胁迫信号的控制，与GCN2,PKR,HRI,PERK等因子发生直接作用，发挥尚待确证的复杂的生物功能。我们将通过在eIF2α的特定位点引入磷酸化的氨基酸，解析eIF2α蛋白质与诸多细胞因子（如PKR）复合物的结构，并从分子机理，特别是磷酸化的角度阐明细胞响应胁迫信号的途径。我们也将对蛋白翻译起始过程中起重要作用的细胞因子做荧光和光交联标记，以求获得对蛋白起始复...
