PD-1人源化小鼠构建繁殖与基因型鉴定.pdf

第 40 卷第 4 期2023 年 8 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.4August 2023论著收稿日期:2023-02-23基金项目:军队实验动物专项基金面上项目(SYDW202005 号)作者简介:共同第一作者李晓娟(1980),女,硕士,研究方向:主要从事实验动物模型研究.E-mail:sxlily55 孙岩峰(1973),女,硕士,副主任医师,主要从事儿科肿瘤方面研究.E-mail:eksyf 通信作者:李瑞生(1969),男,博士,副研究员,主要从事实验动物模型研究.E-mail:314329216 PD-1 人源化小鼠构建繁殖与基因型鉴定李晓娟1 孙岩峰2 修 叶3,4 李兴杰1 李瑞生1(1.中国人民解放军总医院第五医学中心感染病医学部研究所,北京100039)(2.中国人民解放军总医院第三医学中心儿科,北京100039)(3.中国人民解放军总医院第五医学中心肝病医学部研究所,北京100039)(4.福建中医药大学药学院,福州350122)摘要:目的探讨 PD-1 人源化小鼠的繁育与基因型鉴定,为进一步研究相关小分子抑制剂的体内药效评价提供动物模型。方法通过构建 PD-1 人源化小鼠,获得 F1 代鼠 4 只,雌雄交配进行培育繁殖。对每窝仔鼠的数量,存活率等进行记录观察,随后对仔鼠剪尾提取基因组 DNA,用 PCR 法扩增目的基因,然后进行核酸电泳,鉴定基因型。选用 F2 代纯合型与纯合型雌雄交配,野生型与野生型雌雄交配。结果鉴定的 F2 代小鼠有野生型、纯合型和杂合型 3 种基因型。纯合型与纯合型交配获得 F3 代仔鼠基因型全部为纯合型。野生型与野生型交配获得 F3 代仔鼠基因型全部为野生型。结论成功筛选出 PD-1 人源化小鼠纯合子基因型,并有效地进行扩群保种,为今后应用该小鼠模型提供实验保障。关键词:PD-1;人源化小鼠;基因型中图分类号:Q95-3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)04-0034-05DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.04.007Breeding and Genotype Identification of PD-1 Humanized Mice LI Xiaojuan1,SUN Yanfeng2,XIU Ye3,4,LI Xingjie1,LI Ruisheng1(1.Department of Infectious Diseases of Research Institute,the Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital,Beijing 100039,China)(2.Department of Pediatrics,the Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital,Beijing 100039,China)(3.Department of Hepatology of Research Institute,the Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital,Beijing 100039,China)(4.College of Pharmacy,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China)Abstract:ObjectiveTo explore the breeding and genotype identification of PD-1 humanized mice,and provide an animal model for further research on the efficacy evaluation of small molecule inhibitors in vivo.Method Through the construction of PD-1 humanized mice,four F1 generation mice were obtained,which were bred by mating male and female.The number and survival rate of each litter of mice were recorded and observed,and then genomic DNA was extracted from the offspring by tail clipping,the target gene fragment was amplified by PCR,and then the genotype was identified by nucleic acid electrophoresis.The F2 generation homozygous type and homozygous type were used for male and female mating,and wild type and wild type were used for male and female mating.ResultThe F2 generation mice were identified as wild type,homozygous type and heterozygous type.The genotype of F3 offspring obtained from homozygous and homozygous mating were all homozygous.The genotype of F3 offspring obtained from wild type and wild type mating were all wild type.ConclusionThe homozygous 第 4 期李晓娟等:PD-1 人源化小鼠构建繁殖与基因型鉴定 genotype of PD-1 humanized mouse was successfully screened,and the population expansion and seed conservation were effectively carried out,providing experimental guarantee for the future application of this mouse model.Key words:PD-1;humanized mice;genotype近年来恶性肿瘤的发病率呈持续增长趋势已成为严重的社会问题1。随着研究的不断突破,以PD-1/PD-L1 为靶点的肿瘤免疫治疗成为热点,通过抑制 PD-1/PD-L1 通路,从而恢复机体免疫功能并产生抗肿瘤作用2。众所周知,动物模型在实验研究中担负起不可取代的重要作用,研究者多通过基因修饰的技术,将小鼠体内的相关基因替换成人的相关基因从而建立人源化小鼠模型,能够更好的在动物模型中模拟人类疾病并进行研究,此类人源化小鼠广泛应用于肿瘤免疫药物研发、药物临床前评估、人基因功能研究等生物医药领域研究3-5。本实验拟采用 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术来构建PD-1 人源化小鼠,为进一步开发和应用 PD-1 人源化小鼠(h-PD-1)作为药物筛选及评价来提供良好的动物模型。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物:本实验委托赛业模式生物研究中心(太仓)有限公司,实验动物生产许可证号【SCXK(苏)2018-0003】。采用 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术,将 C57BL/6J 小鼠中 PD-1 的胞外区替换为相应的人源片段,同时完整保留小鼠 PD-1 的胞内部分,将构建好的受精卵通过显微注射法送回到代孕鼠输卵管中,最终获得阳性 F0 鼠。对 F0 鼠进行配繁,将性成熟的阳性 F0 鼠与野生型鼠配繁一代,获得 F1 代鼠,并经鼠尾基因组 DNA 的 PCR 检测 PD-1 的基因表达。因此公司提供了 4 只 SPF 级 F1 代小鼠,其中 2 只雌性和 2 只雄性,品系:C57BL/6J,基因型(KI/+),体质量 2024 g,89 周龄。1.1.2人源化小鼠的饲养与繁殖:将获得的 4 只F1 代小鼠按照 SPF 级实验动物标准饲养,采用 1(雄鼠)1(雌鼠)配比的方式进行繁殖。动物饲养在 解 放 军 总 医 院 第 五 医 学 中 心 动 物 实 验 中 心【SYXK(军)2017-0016】,屏障环境按国家标准进行饲养管理,饲料垫料购自斯贝福(北京)生物技术有限公司【SCXK(京)2019-0010】。本实验严格按实验动物使用的 3R 原则给予人道的关怀,通过了解放军总医院第五医学中心动物伦理委员会审查,伦理审批号:IACUC-2021-0020。1.1.3主要试剂与仪器:小鼠基因型快速鉴定试剂盒(北 京 阳 光 英 锐 生 物 科 技 有 限 公 司,货 号:C190801);上样缓冲液&DNA 染料(即用型)(北京阳光英锐生物科技有限公司,货号:C081911);50 bp DNA Ladder(北京金克隆生物技术有限公司,货号:MD0050);PCR 扩 增 仪(PeQlab,型 号:PEQSTAR 2X)。1.2方法1.2.1小鼠基因组 DNA 提取:将获得的 F1 代饲养繁殖的 F2 代小鼠雌雄分笼后,分别剪取小鼠尾部一小段(0.20.5 cm)置入 1.5 mL Eppendorf 管中,参照小鼠基因型快速鉴定试剂盒抽提基因组 DNA。1.2.2PCR 反应及琼脂糖凝胶电泳基因型鉴定:两 组 引 物 设 计:(1)野 生 型:上 游 引 物:5-TTCCTTTCCGCTACAGACAACTC-3,下 游 引 物:5-CTTCACAGAGAGGGACACAGAAGA-3;(2)纯合子:上 游 引 物:5-GAATGGTGACCGGCATCTCTG-3,下游 引 物:5-GCTTTTGTAGTGGTCAGAGTGTGT-3。PCR 反应:下列反应物构成 20 L 的反应体系。上游引物 0.5 L,下 游 引 物 0.5 L,2 Hot Taq Mix 10 L,DNA 模板(Diluted Template)2 L,加 H2O 补足 20 L。采用基因扩增仪进行循环扩增:预变性,95 5 min;变性,95 30 s;退火,55 30 s;延伸,72 1 min,共 35 个循环,最后再延伸 10 min。电泳鉴定:分别取 PCR 扩增产物 10 L,在 2.0%琼脂糖凝胶中以 120 V 电泳 30 min 后于凝胶成像仪中观察拍照。小鼠尾部组织琼脂糖凝胶电泳基因型片段为:野生型:434 bp;纯合型:410 bp;杂合型:434 和 410 bp,按此基因条带鉴别各个基因型小鼠。1.2.3繁育与纯合型小鼠筛选鉴定:对 F2 代小鼠进行基因型鉴定,分别记录各基因型数量以及纯合型数量,计算纯合率。然后采用经典育种与 PCR 相结合的方法对基因敲除小鼠纯合型再次进行筛选。出生 21 d 后仔鼠行 PCR 检测,选出纯合型小鼠。53 实验动物科学40 卷成年 F2 代纯合型与纯合型、野生型与野生型进行交配,对繁殖的 F3 代仔鼠再进行基因型鉴定,确定基因型的稳定性后,继续将纯合型小鼠稳定扩群。2结果2.1人源化小鼠 F2 代配繁及生长情况截至目前,F2 代小鼠共繁殖 5 窝,每窝成活率均95%。母鼠孕期为 21 d 左右,幼鼠由母鼠母乳喂养,哺乳期 21 d 左右,产后 3 周离乳。随着产仔窝数的增加,仔鼠的数量逐渐减少,母鼠的生育能力呈逐渐降低的状态。前 4 窝仔鼠雄性数量均比雌性数量多(表 1)。表 1F2 代繁