Vol.43No.7Jul.2023上海交通大学学报（医学版）JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY(MEDICALSCIENCE)http://xuebao.shsmu.edu.cn上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）AAK1相互作用蛋白的筛选及其调控细胞内整体翻译水平的研究姜贵先1，2，3，胡荣贵4，吴皓1，2，31.上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻咽喉头颈外科，上海200011；2.上海交通大学医学院耳科学研究所，上海200092；3.上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室，上海200092；4.中国科学院大学分子卓越创新中心，上海200032［摘要］目的·探究衔接子相关蛋白激酶1（adaptor-associatedproteinkinase1，AAK1）新的相互作用蛋白，以及除网格蛋白介导的内吞作用外AAK1介导的生物学功能。方法·通过在HEK-293T细胞中分别外源性转染带有标签的AAK1载体与空白对照载体，利用标签特异性的琼脂糖凝胶进行免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CoIP），并联合质谱分析的方法获得潜在与AAK1相互作用的蛋白；通过CoIP初步验证质谱结果；通过荧光共聚焦成像观察AAK1与其潜在结合蛋白在细胞内的空间定位；通过体外纯化重组蛋白，利用谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白沉降实验（glutathione-S-transferasepulldown，GSTPulldown）进一步明确蛋白间是否为直接的相互作用；通过嘌呤霉素结合实验观察AAK1对于细胞内整体翻译水平的调控作用。结果·质谱结果提示AAK1可能与以脆性X相关蛋白1（fragileXmentalretardationsyndrome-relatedprotein1，FXR1）、FXR2、脆性X智力低下蛋白（fragileXmentalretardationprotein1，FMRP）三者为核心的一系列蛋白形成复合体。外源性转染AAK1-3xFLAG及FMRP-MYC质粒，利用抗FLAG琼脂糖凝胶富集AAK1-3xFLAG后，可以检测到FMRP-MYC的表达；利用内源性抗体进行CoIP，发现富集AAK1可以检测到FMRP的表达。荧光共聚焦成像显示EGFP-AAK1与mCherry-FMRP在细胞质中存在部分空间共定位。GSTPulldown显示FMRP可以直接沉淀HIS6-AAK1重组蛋白。嘌呤霉素结合实验显示相同时间内嘌呤霉素标记的细胞内新合成肽段数量与AAK1蛋白表达量呈正相关。结论·AAK1与FMRP在细胞质内存在直接的相互作用，且AAK1可以提高细胞内的翻译水平。［关键词］衔接子相关蛋白激酶1；翻译；质谱；蛋白相互作用［DOI］10.3969/j.issn.1674-8115.2023.07.004［中图分类号］Q291［文献标志码］AScreeningofAAK1interactionproteinsanditsroleinregulatingglobaltranslationlevelincellsJIANGGuixian1,2,3,HURonggui...
