不同非病毒载体对原代肌腱细胞转染效率和毒性作用研究.pdf

交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3肌腱发生损伤后一般通过外源性愈合和内源性愈合进行组织修复，外源性愈合主要由腱鞘和滑膜的成纤维细胞、滑膜细胞等侵入损伤部位，内源性愈合是内部成纤维细胞等直接作用于肌腱断端。过多的外源性愈合通常会导致粘连形成，影响肌腱滑动功能的恢复，因此，增强内源性愈合是促进肌腱愈合并减少粘连的重要途径1-2。由于肌腱内源性细胞稀少，近年来基因治疗肌腱损伤逐渐受到关注。将生长咱文章编号暂1006-2440渊2023冤03-0221-06咱引文格式暂金静，杨纤纤，周友浪.不同非病毒载体对原代肌腱细胞转染效率和毒性作用研究 J.交通医学，2023，37（3）：221-225，234.*基金项目 国家自然科学基金（81871763）。*作者简介 金静，女，汉族，江苏淮安人，生于 1998 年 7 月，硕士在读。研究方向：手外科学。通信作者：周友浪，E-mail：不同非病毒载体对原代肌腱细胞转染效率和毒性作用研究*金静1袁2*袁杨纤纤1袁周友浪1渊1南通大学附属医院临床医学研究中心袁江苏 226001曰2南通大学医学院冤摘要目的院研究并比较非病毒载体纳米球和脂质体对原代肌腱细胞的转染效率以及毒性作用。方法院制备不同 N/P 比例的 PLGA 纳米球，原代培养鸡、大鼠、小鼠肌腱细胞，将低、中、高不同剂量的 pEGFP-N1 质粒负载于纳米球和脂质体，对三种肌腱细胞进行转染。通过荧光拍照和流式细胞分析，检测质粒在 24、48、72、96 h 的转染效率，Western Blot 法检测 GFP 表达水平，CCK8 法检测转染 24、48、72 h 细胞活力。结果院对于鸡肌腱细胞，纳米球的转染效率显著高于脂质体，尤其是 NP10 的 GFP 表达最明显，且对细胞无毒性作用。对于大鼠肌腱细胞，NP10 的转染效率最佳，其次是 NP6 和脂质体，但脂质体降低了细胞活性。对于小鼠肌腱细胞，纳米球和脂质体的转染效率均较低，且随着时间与剂量的增加，细胞毒性作用越来越明显。结论院NP10 是鸡和大鼠肌腱细胞转染质粒的最佳试剂，但小鼠肌腱细胞最合适的转染试剂还需进一步探索。关键词非病毒载体；纳米球；脂质体；质粒；原代肌腱细胞中图分类号Q2-33文献标志码ADOI10.19767/ki.32-1412.2023.03.001Study on the transfection efficiencyand toxicity of primary tendon cells by different non-viral vectorsJIN Jing1袁2,YANG Qianqian1,ZHOU Youlang1(1Clinical Medical Research Center,Affiliated Hospital of Nantong University,Jiangsu 226001;2School of Medicine,Nantong University)AbstractObjective:To investigate and compare the transfection efficiency and toxicity of non-viral vectornanoparticles and liposomes on primary tendon cells.Methods:PLGA nanoparticles with different NP ratios were prepared,and the tendon cells of chicken,rat and mouse were cultured.The low,medium and high doses of pEGFP-N1 plasmidwere loaded into nanoparticles and liposomes,and the three cells were transfected.The transfection efficiency of the plas鄄mid at 24,48,72 and 96 hours was detected by fluorescence photography and flow cytometry.The expression level of GFPwas detected by Western Blot,and cell activity was detected by CCK8 at 24,48 and 72 hours after transfection.Results:For chicken tendon cells,the transfection efficiency of nanoparticles was significantly higher than that of liposomes,espe鄄cially the GFP expression of NP10 was the most obvious,and it was not toxic to cells.For rat tendon cells,NP10 had thebest transfection efficiency,followed by NP6 and liposomes,but liposomes reduced cell activity.For mouse tendon cells,the transfection efficiency of nanoparticles and liposomes was low,and the toxic effect on cells became more and more ob鄄vious with the increase of time and dose.Conclusion:NP10 is the best transfection reagent for plasmid transfection inchicken and rat tendon cells,but the most suitable transfection reagent for mouse tendon cells needs further exploration.Key wordsnon-viral vector;nanoparticle;liposome;plasmid;primary tendon cell窑 论著与基础研究 窑221窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.3因子基因转入肌腱细胞中，可持续、高效翻译出有利于肌腱细胞生长的生长因子，进而促进肌腱内源性修复3-5。基因治疗中载体主要包括病毒载体与非病毒载体，考虑到生物相容性和伦理问题，目前非病毒载体被广泛研究，其中脂质体是一种较为成熟的非病毒载体，已证实在多种细胞中具有较高的转染效率6。本课题组研发的非病毒载体 PLGA 纳米球具有缓慢释放和生物相容性高的优势，并在鸡、大鼠的肌腱细胞中成功转染质粒、siRNA 等7-9。本文拟比较三种 PLGA 纳米球（NP6，NP8，NP10）和脂质体（Lipo）对三种常用动物（鸡、大鼠、小鼠）肌腱细胞转染质粒的效率以及毒性的影响，探索转染质粒效率最高、毒性最小的转染试剂，以促进基因治疗在肌腱修复中的进一步应用与发展。1材料与方法1.1转染试剂及 pEGFP-N1 质粒的制备通过复乳法获得纳米球，将 200 mg 聚（D，L-丙交酯-co-乙交酯）溶解于 2 mL 二氯甲烷，然后将之缓慢滴加在 6 mL 的 7%（w/v）聚乙烯醇（PVA）（Sigma-Aldrich，美国）溶液中，使用超声仪（Bandelin electronic，德国）超声处理 60 s 以产生初级乳液。将初级乳液添加到 100 mL 1%（w/v）PVA 溶液中，再次超声处理180 s 以形成双乳液，在室温下搅拌 24 h 挥发二氯甲烷。13 000 r/min 离心 5 min，分离 PLGA 纳米颗粒，去离子水洗涤 2 次。按不同 N/P 比（聚乙烯亚胺基摩尔数/质粒磷酸基摩尔数）得到 NP6，NP8 和 NP10 纳米球。脂质体（ThermoFisher LL3000015，美国）。pEGFP-N1 载体由上海吉凯基因医学科技股份有限公司构建，其携带的增强型绿色荧光蛋白（GFP）基因可以检测不同转染试剂对肌腱细胞的转染效率。1.2原代肌腱细胞培养使用 PBS 缓冲液配制浓度为 1 mg/mL 的玉型胶原酶（索莱宝科技有限公司，中国）溶液，过滤后存于 4 益待用。动物处死后，在超净台下用无菌器械取下肌腱组织，PBS 清洗 6 次。组织剪碎后置于玉型胶原酶溶液中，在细胞培养箱中消化 2 h。细胞筛过滤细胞悬液，1 000 r/min 离心 5 min获取细胞沉淀，以 DMEM 高糖培养基（含 10%胎牛血清）重悬细胞，用于后续实验。1.3细胞转染将肌腱细胞接种于 24 孔板，待细胞融合度为 70%左右时，将低、中、高（1 滋g/孔、2 滋g/孔、3 滋g/孔）三种剂量的 N1 质粒分别负载于纳米球（1 滋L/孔、2 滋L/孔、3 滋L/孔），室温孵育 15 min 后加入到细胞上清中，N1 质粒与脂质体的结合按试剂说明书操作。所有孔均在转染后 24 h 换液，并在转染24 h、48 h、72 h 和 96 h 进行荧光拍照及转染效率检测。与 24 孔板转染方法相同，将细胞接种于 96 孔板，根据孔径底面积的大小，将低、中、高（0.2 滋g/孔、0.4 滋g/孔、0.6 滋g/孔）三种剂量的 N1 质粒通过纳米球（0.2 滋L/孔、0.4 滋L/孔、0.6 滋L/孔）和脂质体转染至细胞中，分别在转染 24 h、48 h 和 72 h 三个时间点检测细胞活性。1.4转染效率检测细胞经 PBS 清洗后置于荧光显微镜下（Leica DMR 3000，德国）观察并拍照（文中每种细胞仅展示纳米球和 Lipo 转染效率最高的荧光图片），随后用胰酶消化细胞，完培终止消化后，1 000 r/min 离心 5 min，PBS 重悬，使用流式细胞仪（Attune NxT，Invitrogen，美国）检测 GFP 阳性信号，未转染的细胞作为阴性对照。1.5Western Blot 法采用 RIPA 裂解液在 4 益下提取 2 滋g 质粒/孔剂量下的细胞蛋白，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质电泳，然后转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂牛奶封闭 1 h。以抗兔 GFP 一抗（1颐1 000，CST，美国）4 益孵育过夜，TBST 洗涤 3 次后，以荧光二抗（1颐10 000，Lincoln，美国）在室温下孵育 2 h，再次清洗膜后，采用奥德赛红外成像系统（LI-COR，Lincoln，美国）扫描并显示出条带，用 Image J 软件定量蛋白条带的灰度值。1.6CCK8 法测定细胞活力完培稀释 CCK8 浓缩液（诺唯赞公司，中国）配制成 1伊CCK8 溶液，弃细胞上清，每孔加入 100 滋L 1伊CCK8 溶液，在细胞培养箱孵育 2 h，使用酶标仪（SpectraMax M5，美国）在450 nm 激发光波长下读取 OD 值。1.7统计学处理应用 GraphPad 软件对数据进行分析处理。计量资料以均数依标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1鸡肌腱细胞转染效率及细胞活性由表 1 可见，1 滋g 质粒转染 24 h 时，Lipo 转染效率优于 NP6、222窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 3 期 Med J of Communications,