r中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1446.1-2004猪传染性胃肠炎阻断酶联免疫吸附试验BlockingELISAfortransmissiblegastroenteritisofswine2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和匡国家质量监督检验检疫总IF"SN/T1446.1-2004mli胃本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人:李健、胡永强、王巧全、李树清。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T1446.1-2004猪传染性胃肠炎阻断酶联免疫吸附试验1范围本标准规定了猪传染性胃肠炎阻断酶联免疫吸附试验(ELISA)试验方法。本标准适用于猪传染性胃肠炎的检疫、流行病学调查、抗体水平检测以及与猪呼吸道冠状病毒(PRCV)感染的区别诊断。2仪器设备、试荆和材料2.1仪器设备普通天平、分析天平、200FuL可调移液器、精密滴头、恒温箱、酶标仪、洗板机等。2.2试荆配制见附录A。所有化学试剂均为分析纯。2.3材料2.3.1猪传染性胃肠炎标准抗原微量板。2.3.2标准TGEV阳性对照血清、TGEV/PRCV阴性对照血清,PRCV阳性对照血清。2.3.3标准抗TGEV单克隆抗体、抗TGEV/PRCV单克隆抗体2.3.4辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠IgG:商业采购，使用前对同一批号的产品进行工作浓度测定。操作程序3.、样品血清或血浆。3.2操作步骤3.2.1使用前取出所有试剂，平衡到室温(2o0C--25,C)。将反应板/条做好标记3.2.2用洗液洗板三次，每次5min，最后一次拍干去除所有残留液体。3.2.3立即分别加人TGEV,PRCV阳性对照血清和TGEV/PRCV阴性对照血清到相应血清对照孔，100pL/孔。具体添加见图1,3.2.4用多通道移液器添加PBST到所有样品孔，50t}L/孔。然后加人未稀释的待检血清,50KL/孔，每份样品两孔。见图1,3.2.5密封微量板，370C温育2h,3.2.6按3.2.2操作洗板3.2.7立即加人工作浓度的标准抗TGEV单克隆抗体和抗TGEV/PRCV单克隆抗体，到对应血清孔，100pL/孔(见图1),3.2.8密封微量板，室温(200C^-250C)温育30min,3.2.9按3.2.2操作洗板。3.2.10加入工作浓度的HRP标记抗鼠IgG.100I}L/孔，密封微量板，室温(200C--250C)温育30min3.2.11按3.2.2操作洗板。3.2.12快速加人底物溶液，100EaL/孔，暗盒室温(200C-250C)温育20min左右至颜色变化。SN/T1446.1-20043.2.13加人终止液终止反应，50pL/孔。终止液添加顺序与底物溶液添加顺序相同。颜色由蓝色转变为黄色。3.2.14充分振荡，用酶标仪在波长450nm处测吸光值(OD,So)，空气作为...
