中华人民共和国国家标准GB15193-12一94体外哺乳类细胞(V79/HGPRT)基因突变试验V79/HGPRTgenemutationtest主肠内容与适用范围本标准规定了体外哺乳类细胞(V79/HGPRT)基因突变试验的基本技术要求。本标准适用于需要进行食品安全性评价的用作或用于食品的化学物质。2原理细胞在正常培养条件下，对6-TG的毒性作用敏感，不能生存，在致癌物和致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制次黄嚓吟鸟嗦岭磷酸核糖转移酶(HGPRT)的结构基因发生突变，不能再产生HG-PRT，从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用。这些突变细胞在含有6-TG的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。根据突变集落形成数，计算突变率以判定受试物的致突变性。3材料和试剂3.1细胞:使用中国仓鼠肺(V79)细胞株。为了减少自发突变率，正式实验前先将野生型细胞群体中存在的自发HGPRT座位突变体选择性杀灭，方法是将野生型细胞接种于含次黄嗦吟及胸腺呛咤，氨甲蝶吟，甘氨酸的MEM培养液中培养1周，然后重新接种于MEM培养液中。3-2培养液:采用MEM(Eagle)基础培养液或DMEM培养液，补以10%小牛血清及适量抗菌素(青霉素，链霉素)。3.3磷酸缓冲液(无钙、镁PBS)磷酸二氢钾(KH2PO,)200mg磷酸氢二钠(Na2HP0,·12H}O)2.89g氯化钾(KCl)200mg氯化钠(NaCD8.0g双蒸水1000mL高压消毒，1210C,0.103MPa,20min,3.4胰蛋白酶/EDTA溶液:用无钙、镁PBS配制，胰酶的浓度为。.05%,EDTA的浓度为0.02%,胰蛋白酶与EDTA溶液按1-1混合。-200C贮存。3.5受试物:最好能溶于培养液。也可溶于二甲基亚矾(DMSO)，其浓度应低于0.5%(V/V)o3.6阳性对照物:可根据受试物的性质和结构选用不同的阳性对照物，例如甲基磺酸乙酷(EMS)，丝裂霉素C(MMC)，甲基硝基亚硝基弧(MNNG),苯并(a)花(BP)等。3.76-TG用。.5%碳酸氢钠溶液配成1.0mg/mL,40C贮存。3-8大鼠肝匀浆s-9混合物，按Ames试验程序制备。4实验步骤4.1细胞准备:将5X105个细胞接种于直径为100mm壬贝L由,1一37坠5丝纂鱼互叁造墨笙史丛置中华人民共和国卫生部1994一08一10批准1994一08-10实施GB15193.12一9424ho4.2接触受试物:吸去培养液,PBS洗两次，加人无血清培养液及一定浓度的受试物(需代谢活化者同时加入大鼠肝匀浆S-9混合物)，置于培养箱中2h，结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞两次，换入含10%血清的培养液，继续培养”一22ho4.3表达:接触受试物的细胞继续培养19^22h后用胰酶-EDTA消化，待细胞脱落后，加人含10%血清培养液终止消化，混匀，放入离心管以800^-1000rjmin的速度离...
