ICS11.220B41中华人民共和国农业行业标准NY/T544-2002猪流行性腹泻诊断技术Diagnostictechniquesforporcineepidemicdiarrhoea2002一08一27发布2002一12一01实施中华人民共和国农业部发布355NY/'r544-2002前言猪流行性腹泻是猪的严重传染病之一，症状与猪传染性胃肠炎相似，病毒形态上也基本相同，但两者的抗原性不一样。本标准是根据国内研究成果和参考国外同类研究成果编写的。本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国人民解放军军需大学。本标准主要起草人:马思奇、王明、宣华、冯力、终有恩。NY/T544-2002猪流行性腹泻诊断技术1范围本标准规定了猪流行性腹泻(PED)的病毒分离鉴定与检测病毒抗原的直接免疫荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA),检测抗体的血清中和试验、间接ELISA试验技术。本标准适用于对猪流行性腹泻的诊断、产地检疫及流行病学调查等。2病毒分离与鉴定2.1材料准备2.1.1器材倒置显微镜，冷冻离心机，微孔滤器，细胞培养瓶，盖玻片，温箱等。2.1.2培养基及溶液的配制磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞培养液、病毒培养液及N-2-经乙基呢嗓-N'-2一乙烷磺酸(HEPES)液(配制方法见附录A),2.1.3细胞Vero细胞系。2.2病毒分离22-1病料采集采病仔猪空肠内容物及小肠内容物用于分离病毒，样品冷冻保存。2.2.2病料处理将采集的小段空肠连同肠内容物用含1000IU/mL青霉素,1000Wg/mL链霉素,PBS液制成5倍悬液，在4℃条件下3000r/min离心30min，取上清液，经0.22pm徽孔滤膜过滤，分装，一20℃保存备用2.2.3接种及观察将过滤液(病毒培养液的10%)接种于Ver。细胞单层上，同时加过滤液量50%的病毒培养液，37C吸附Ih，根据组织堵养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量，置37℃培养，逐日观察3d-4d，按致细胞病变作用(CPE)变化情况，可盲传2代一3代。2.3结果判定CPE变化的特点是:细胞面粗糙，颗粒增多，有多核细胞(7个~8个甚至几十个〕，并可见空斑样小区，细胞逐渐脱落，这是特征性的CPE，可与(猪)传染性胃肠炎(TGE)病毒的CPE相区别。同时在细胞培养瓶中加盖玻片，收毒后用直接荧光做鉴定试验。有条件时可进行电镜观察，用负染法在阳性样品中电镜观察可见到冠状病毒粒子。3直接荧光抗体法3.13.1.13.1.23.1.3材料准备器材:荧光显微镜、冷冻切片机、载玻片、盖玻片、温箱、滴管等。荧光抗体(FA),溶液配制:磷酸盐缓冲液(P...
