ICS11．220B41固雪中华人民共和国国家标准GB／T27532--20112011—11—21发布犬瘟热诊断技术Diagnostictechniquesforcaninedistemper2012—03—01实施宰瞀鹃鬻瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“19刖昌GB／T27532--2011本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：单虎、黄娟、熊炜、温建新、秦晓冰、朱来华、宫文妮、袁小远、孙园园、马晶。犬瘟热诊断技术GB／T27532--20111范围本标准规定了犬瘟热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT—PCR检测的操作方法。本标准适用于犬瘟热的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT-PCR检测适用于犬瘟热的病原诊断。2试剂和材料2．1改良最低要素营养液(DMEM)培养基：配方参见附录A。2．2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。2．3磷酸盐缓冲液(PBS)：配制参见附录A。2．4青霉素、链霉素：配方参见附录A。2．5CDV阳性血清：中和抗体效价1；1024。2．6CDV阴性血清：无CDV感染的犬血清。2．7酶结合物：HRP标记的葡萄球菌A蛋白(SPA)。2．8底物溶液：配制参见附录A。2．9过氧化氢甲醇溶液：配制参见附录A。2．10盐酸酒精溶液：配制参见附录A。2．11胰蛋白酶溶液：配制参见附录A。2．12Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U／uL，一20℃保存。2．13逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为50U／iLL，--20℃保存。2．14RNA酶抑制剂(40U／tLL)：一20℃保存。2．15dNTP：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol／L，一20℃保存。2．16引物：浓度为20tzmol／L，其序列如下：上游引物(CDVF)：5’CGAGTCTTTGAGATAGGGTT3’；下游引物(CDVR)：5’CCTCCAAAGGGTTCCCATGA37。2．17随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为50ttmol／L，一20℃保存。2．18DEPC水：自配(参见附录A)，或购买商品化DEPC水。2．19Trizol试剂：4℃保存。2．20异丙醇：使用前预冷至一20℃。2．2175％乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至一20℃。2．221．5mL无RNA酶的Eppendorf管。2．230．2mL无RNA酶的PCR薄壁管。3器材和设备3．1细胞培养瓶(中号瓶)。3．2二氧化碳培养箱。3．3恒温水浴箱(5℃～100℃)。3．4普通光学...
