ICS65.020.30B43团体标准T/SDAA0045－20212021－11－30发布2021－12－31实施山东省畜牧协会发布多杀性巴氏杆菌的检测PCR法DetectionofPasteurellamultocidabyPCR全国团体标准信息平台T/SDAA0045－2021全国团体标准信息平台T/SDAA0045－2021前言本文件按照GB/T1.1—2020的规定起草。本文件由山东省畜牧协会提出并归口。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件起草单位：青岛农业大学、青岛农业大学海都学院、山东省动物疫病预防与控制中心。本文件主要起草人：韩先杰、邱慧玲、兰邹然、陈甫、高善颂、宋春阳、张廷荣、于光辉、于忠娜。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台T/SDAA0045－2021全国团体标准信息平台T/SDAA0045－2021多杀性巴氏杆菌的检测PCR法1范围本文件规定了猪多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法。本方法适用于猪多杀性巴氏杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T564-2016猪巴氏杆菌病诊断技术3原理根据多杀性巴氏杆菌的基因序列设计一对特异性引物，以多杀性巴氏杆菌的DNA核酸为模板，扩增特异的目的DNA片段。扩增的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳，根据DNA条带的大小来判断结果。4试剂或材料除非另有规定，所用试剂均为分析纯。4.1水：GB/T6682，一级。4.25%绵羊鲜血平板4.3革兰氏染液4.42×TaqMasterMix4.5DNAMarkerDL20004.6琼脂糖4.7TAE缓冲液4.84SGreenPlus无毒核酸染料全国团体标准信息平台T/SDAA0045－20215仪器设备5.1生物安全柜：配ULPA超高效空气过滤器。5.2高速冷冻离心机：转速不低于12000rpm/min。5.3PCR仪：最大升降温速率为4℃/秒，温度范围4℃~99℃。5.4凝胶成像仪：图像分辨率不低于500万像素，灵敏性可检测出低于20pgEB染色的双链DNA。5.5紫外透射仪：透射紫外光源波长为302nm。5.6电泳仪，恒压输出范围：3～300V、恒流输出范围：1～400mA、恒功率输出范围：1～120W。6样品按照NY/T541的规定采集、贮存样品。7试验步骤7.1细菌的分离及纯培养7.1.1在生物安全柜内，将无菌采取的患病动物心血用接种环直接在绵羊鲜血平板上划线接种。对采集的肺脏、肝脏或脾脏，用酒精灯火焰烧红的刀片烧烙肺脏、肝脏或脾脏的表面，用无菌手术剪刀在烧烙部位...
