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第三章第三章 细胞工程实验室配置及基本技术细胞工程实验室配置及基本技术 1 1 实验设置实验设置 2 2 基本技术要求无菌环境与无菌操作基本技术要求无菌环境与无菌操作 3 3 培养条件培养条件 4 4 离体培养的营养需求离体培养的营养需求 1 1 实验室设置实验室设置 细胞工程实验室必须满足三个基本的需要：细胞工程实验室必须满足三个基本的需要：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；无菌操作；控制培养。控制培养。1.1.实验室设置实验室设置 一一.实验室组成实验室组成 1 1基本实验室基本实验室 准备室准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。宽敞明亮，通风条件好。接种室接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。培养室培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。和清洁。1.1.实验室设置实验室设置 一一.实验室组成实验室组成 2 2辅助实验室辅助实验室 细胞学实验室细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。条件的情况下可建立此实验室。生化分析室生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。1.1.实验室设置实验室设置 一一.实验室组成实验室组成 Culture room Preparation room sterilizing Sterile operation Cytology room Transition area 实验室布局示意图 2.2.实验室设置实验室设置 二二.基本设备配置基本设备配置 基本设备基本设备 冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。搅拌器。灭菌设备灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾 消毒器、紫外灯。消毒器、紫外灯。无菌操作设备无菌操作设备 净化工作台、接种箱。净化工作台、接种箱。光温控制设备光温控制设备 时间程序控制器、空调及温度感应器。时间程序控制器、空调及温度感应器。细胞培养设备细胞培养设备 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、摇床、生物反应器等。生物反应器等。细胞学鉴定设备细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。2.2.实验室设置实验室设置 二二.基本设备配置基本设备配置 灭菌设备灭菌设备 2.2.实验室设置实验室设置 二二.基本设备配置基本设备配置 无菌操作设备无菌操作设备 2.2.实验室设置实验室设置 二二.基本设备配置基本设备配置 光光照照培培养养及及控控制制设设备备 2.2.实验室设置实验室设置 二二.基本设备配置基本设备配置 2.2.实验室设置实验室设置 二二.基本设备配置基本设备配置 2.2.基本技术基本技术 一一.洗涤技术洗涤技术 洗涤液：洗涤液：弱弱 用重铬酸钾用重铬酸钾5050g g加入蒸馏水加入蒸馏水1 1L L，加热溶化，冷却后加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸再缓慢加入浓硫酸9090mlml。中中 用重铬酸钾用重铬酸钾5050g g加入蒸馏水加入蒸馏水100100mlml，加热溶化，冷加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸却后再缓慢加入浓硫酸875875mlml。强强 与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸到重铬酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸1 1L L加入重铬酸钾加入重铬酸钾5050g g。2.2.基本技术基本技术 一一.洗涤技术洗涤技术 洗涤方法洗涤方法 玻璃器皿洗涤玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿新的玻璃器皿 已使用过的试管、烧杯、三角瓶已使用过的试管、烧杯、三角瓶 吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品 塑料用品洗涤塑料用品洗涤 一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较 强，因此冲洗时必须反复多次，最后用强，因此冲洗时必须反复多次，最后用 蒸馏水冲洗。蒸馏水冲洗。金属用品洗涤金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火 焰干燥。焰干燥。2.2.基本技术基本技术 二二.灭菌、消毒灭菌、消毒 物理方法：物理方法：物理灭菌物理灭菌 干热、湿热、射线处理干热、湿热、射线处理、过滤、过滤、离心沉淀等离心沉淀等 化学方法：化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌消毒剂、抗菌素灭菌 外植体灭菌技术：外植体灭菌技术：对外植体伤害小，灭菌效对外植体伤害小，灭菌效 果好果好 2.2.基本技术基本技术 二二.灭菌、消毒灭菌、消毒 培养基：培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌.玻璃器皿：玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热 至至1504015040分钟，或分钟，或12021202小时小时.金属器皿：金属器皿：干热灭菌干热灭菌.接种室：接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲 醛加高锰酸钾，一般每醛加高锰酸钾，一般每100100mlml甲醛加甲醛加5 5g g高锰酸钾高锰酸钾.外植体：外植体：一般使用化学灭菌剂一般使用化学灭菌剂 灭菌灭菌.几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较 消 毒 剂 使用浓度(%)消毒时间(min.)效 果 残液去除难易 次氯酸钙/纳 10 530 好 易 新洁尔灭 1020 530 好 易 氯化汞 0.11 210 最好 最难 过氧化氢 1012 515 较好 最易 抗菌素 450mgl-1 3060 较好 较难 3.3.培养条件培养条件 一一.光照的影响光照的影响 光照时间光照时间 光照强度光照强度 光质光质 3.3.培养条件培养条件 二二.温度的影响温度的影响 在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细胞分裂速率，而适当提高温度则有利于细胞伸长，在一胞分裂速率，而适当提高温度则有利于细胞伸长，在一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓，定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。而且使细胞的质量增加。温度对菊芋愈伤组织细胞生长的影响 培养温度()接种时单个细胞平均鲜重(微克)到指数生长期末单个细胞重(微克)10.0 0.44 0.20 15.0 0.42 0,12 25.0 0.44 0.07 30.0 0.42 0.06 32.0 0.52 0.03 3.3.培养条件培养条件 二二.温度的影响温度的影响 3.3.培养条件培养条件 三三.湿度的影响湿度的影响 组织培养中湿度的影响有两个方面：组织培养中湿度的影响有两个方面：一是培养容器内的湿度条件，一是环境的湿一是培养容器内的湿度条件，一是环境的湿度条件。容器内的相对湿度几乎是度条件。容器内的相对湿度几乎是100%100%；二是环境的相对湿度一般要求二是环境的相对湿度一般要求707080%80%。3.3.培养条件培养条件 四四.pHpH值值 通常使用的通常使用的pHpH值范围是值范围是5.5.0 06.56.5。pHpH在在4.04.0以下以下或或7.07.0以上培养物就不能正常生长。以上培养物就不能正常生长。3.3.培养条件培养条件 五五.渗透压渗透压 事实上为了某些培养需要，在设计培养基时就事实上为了某些培养需要，在设计培养基时就应该考虑渗透压的问题，如应该考虑渗透压的问题，如WhiteWhite培养基的渗透培养基的渗透压为压为0.150.15个大气压，个大气压，MSMS培养基为培养基为1.91.9个大气压。个大气压。此外，培养基的渗透压除用蔗糖调节外，常用此外，培养基的渗透压除用蔗糖调节外，常用的还有甘露醇，山梨醇等。的还有甘露醇，山梨醇等。3.3.培养条件培养条件 六六.气体影响气体影响 COCO2 2、O O2 2 3.3.培养条件培养条件 六六.气体影响气体影响 4.4.离体培养的营养需求离体培养的营养需求 一一.无机盐类无机盐类 二二.有机化合物有机化合物 三三.植物激素植物激素 四四.其它附加成分其它附加成分 4.4.离体培养的营养需求离体培养的营养需求 一一.无机盐类无机盐类 植物生长发育的基本元素植物生长发育的基本元素:N,P,K,Ca,Mg,S,Fe,Mn,N,P,K,Ca,Mg,S,Fe,Mn,B,Cu,Zn,Mo,Cl,C,H,OB,Cu,Zn,Mo,Cl,C,H,O。必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面：必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面：一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的代谢活动；酶的活化剂，参与植物的代谢活动；三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用；稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用；四是在发育过程中，影响组织器官的建成。四是在发育过程中，影响组织器官的建成。4.4.离体培养的营养需求离体培养的营养需求 一一.无机盐类无机盐类 大量元素大量元素 培养基的大量元素使用量一般在每升几十至培养基的大量元素使用量一般在每升几十至 几千毫克。大量元素包括几千毫克。大量元素包括C,H,O,N,P,K,C,H,O,N,P,K,Ca,Mg,SCa,Mg,S 微量元素微量元素 微量元素的用量一般低于微量元素的用量一般低于1010-5 51010-7 7克分子浓克分子浓 度。植物所需的微量元素有度。植物所需的微量元素有FeFe、CuCu、ZnZn、B B、MoMo、MnMn、CoCo 4.4.离体培养的营养需求离体培养的营养需求 二二.有机化合物有机化合物 有机化合物有机化合物 糖；维生素；肌醇；氨基酸及其糖；维生素；肌醇；氨基酸及其它如水解酪蛋白、水解乳蛋白等它如水解酪蛋白、水解乳蛋白等 4.4.离体培养的营养需求离体培养的营养需求 三三.植物激素植物激素 生长素：生长素：IAAIAA、NAANAA、2,42,4-D D、IBAIBA等。等。细胞分裂素：细胞分裂素：KTKT、BABA、玉米素等。玉米素等。其它：其它：GAGA3 3、ABAABA、B B9 9等。等。4.4.离体培养的营养需求离体培养的营养需求 四四.其它附加成分其它附加成分 琼脂琼脂 活性炭等活性炭等 4.4.离体培养的营养需求离体培养的营养需求 MS MS 培养基配方（培养基配方（mglmgl-1 1)KNO3 1900 ZnSO4 7H2O 8.6 NH4NO3 1650 NaMoO4