中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5204—2020植物病原细菌筛查MALDI-TOFMS法PlantpathogenicbacteriascreenMALDI-TOFMSmethod2020-12-30发布2021-07-01实施ICS65.020.01CCSB16中华人民共和国海关总署发布SN/T5204—2020I前言本文件按照GB/T1.1—2020给出的规则起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。本文件主要起草人：冯建军、陈枝楠、刘杰、王飞、龙海、章桂明。1SN/T5204—2020植物病原细菌筛查MALDI-TOFMS法1范围本文件规定了植物病原细菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）检测方法。本文件适用于植物病原细菌纯培养物快速筛查检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4方法原理细菌细胞体内大约含有200个~6000个蛋白质分子，占菌体干重50%左右，具有种属特征，可通过MALDI-TOFMS测定小分子多肽分子量及结构等信息，实现细菌的种属鉴定。5仪器及用具5.1仪器高压灭菌锅、光照培养箱、天平（感量1/100；1/10000）、水浴锅、纯水仪、旋涡振荡器、台式离心机、冰箱、超净工作台、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪、超声波震荡仪。5.2用具培养皿、量筒、吸管、酒精灯、滤纸、微量移液器（0.5μL、2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）、PCR反应管（0.2mL、0.5mL、1mL）、Tip头（0.1μL~10μL、5μL~200μL、100μL~1000μL）、质谱分析样品靶。6试剂、溶液和培养基所有试剂、溶液和培养基配方见附录A。7筛查方法7.1菌株培养供试菌株划线接种到NBY等相关培养基活化培养，28℃±2℃黑暗培养48h后备用。2SN/T5204—20207.2菌体处理具体步骤见附录B。7.3质谱分析7.3.1仪器条件7.3.1.1仪器：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。7.3.1.2激光能量：根据样品，可在0%~100%范围调节。7.3.1.3质谱扫描范围：1000Da~20000Da。7.3.1.4检测方式：线性正离子检测方式。7.3.1.5微生物指纹图谱库：仪器自带数据库或自建同等类型数据库。7.3.2质控标准品校准每次检测样品前推荐使用标准品PeptideCalibrationStandard和ProteinCalibrationStandardI的混合液或者同等类型标准品的特征峰校准质谱仪。7.3.3点样7.3.3.1在质谱靶上点1μL上清液，每个样品点4个重复。7.3.3.2取1μL标准校正溶液作为对照。7.3.3.3室温自然晾干后，尽快点上1μL基质，晾干。7.3.4鉴定将样品靶标板放入仪器内，设定...
