SNT 5204-2020 植物病原细菌筛查 MALDI-TOF MS法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52042020植物病原细菌筛查MALDI-TOF MS法Plant pathogenic bacteria screenMALDI-TOF MS method2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 65.020.01CCS B 16中华人民共和国海关总署发 布SN/T 52042020I前 言本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。本文件主要起草人：冯建军、陈枝楠、刘杰、王飞、龙海、章桂明。1SN/T 52042020植物病原细菌筛查 MALDI-TOF MS 法1 范围本文件规定了植物病原细菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测方法。本文件适用于植物病原细菌纯培养物快速筛查检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4方法原理细菌细胞体内大约含有 200 个 6 000 个蛋白质分子，占菌体干重 50%左右，具有种属特征，可通过 MALDI-TOF MS 测定小分子多肽分子量及结构等信息，实现细菌的种属鉴定。5仪器及用具5.1 仪器高压灭菌锅、光照培养箱、天平（感量 1/100；1/10000）、水浴锅、纯水仪、旋涡振荡器、台式离心机、冰箱、超净工作台、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪、超声波震荡仪。5.2 用具培养皿、量筒、吸管、酒精灯、滤纸、微量移液器（0.5 L、2 L、10 L、20 L、100 L、200 L、1 000 L）、PCR 反应管（0.2 mL、0.5 mL、1 mL）、Tip 头（0.1 L10 L、5 L200 L、100 L1000 L）、质谱分析样品靶。6试剂、溶液和培养基所有试剂、溶液和培养基配方见附录 A。7筛查方法7.1 菌株培养供试菌株划线接种到 NBY 等相关培养基活化培养，28 2 黑暗培养 48 h 后备用。2SN/T 520420207.2 菌体处理具体步骤见附录 B。7.3 质谱分析7.3.1 仪器条件7.3.1.1 仪器：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。7.3.1.2 激光能量：根据样品，可在 0%100%范围调节。7.3.1.3 质谱扫描范围：1000 Da20000 Da。7.3.1.4 检测方式：线性正离子检测方式。7.3.1.5 微生物指纹图谱库：仪器自带数据库或自建同等类型数据库。7.3.2 质控标准品校准每次检测样品前推荐使用标准品 Peptide Calibration Standard 和 Protein Calibration Standard I 的混合液或者同等类型标准品的特征峰校准质谱仪。7.3.3 点样7.3.3.1 在质谱靶上点 1 L 上清液，每个样品点 4 个重复。7.3.3.2 取 1 L 标准校正溶液作为对照。7.3.3.3 室温自然晾干后，尽快点上 1 L 基质，晾干。7.3.4 鉴定将样品靶标板放入仪器内，设定激光能量、质谱扫描范围等参数，进行质谱数据采集。然后将经过处理的质谱数据自动/手动导入本地微生物图谱库，将获得的质谱分析图谱与微生物指纹图谱库进行比对，通过仪器自带软件计算 log（score）值，判断未知菌的种类。8结果判定8.1 若 log（score）值大于等于 2.2 小于等于 3.0，则可判定植物病原细菌的种。8.2 若 log（score）值大于等于 2.0 小于 2.2，则可判定植物病原细菌的属。8.3 若 log（score）值小于 2.0，则无法判定植物病原细菌的属。8.4 需进一步判定，可根据细菌相关标准方法鉴定；无相应标准的按照常规细菌鉴定方法鉴定。9样品与原始数据保存9.1样品保存存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存 6 个月，以备复验，如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。9.2原始数据保存样品检测结束后，其原始记录单、谱图和检验报告或证书应归档，妥善保管以备复验、谈判和仲裁。9.3菌株保存分离到的菌株进行超低温保存或冻干保存，以备复验、谈判和仲裁。3SN/T 52042020附 录 A（规范性附录）试剂、溶液与培养基A.1试剂无水乙醇、异丙醇、乙腈、三氟乙酸（TFA）和甲醇，以上有机溶剂均为色谱级；无菌去离子水、-氰基-4-羟基肉桂酸（Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）、标准品 Peptide Calibration Standard 和 Protein Calibration Standard I。A.2溶液A.2.1基质溶液：称量 5 mg HCCA 溶解于 500 L 乙腈：10%三氟乙酸：无菌去离子水（2：1：1）溶剂中，形成饱和溶液约 10 mg/mL 的基质溶液备用。每次使用前新鲜配制。A.2.2标准校正溶液：分别选取 1 管 Peptide Calibration Standard 和 Protein Calibration Standard I，加入 125 L 0.1%TFA 的 50%乙腈溶剂，充分混匀后，-20 保存备用。或者使用同等类型标准品溶液。A.3培养基A.3.1营养肉汁酵母液培养基（NBY）：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨 5 g，酵母粉 2 g，三水磷酸氢二钾 2.6 g，磷酸二氢钾 0.5 g，葡萄糖 2.5 g，蒸馏水 1000 mL，121 高温灭菌 15 min 后加入 1 mol/L 硫酸镁溶液 1 mL；对于 NBY 固体培养基，需要加入 15 g 琼脂粉。A.3.2营养肉胨培养基（NB）：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨 5 g，蒸馏水 1000 mL，pH=7.07.2，121 灭菌 15 min，若是需要固体培养基（NA），请加入 15 g 琼脂粉。4SN/T 52042020附 录 B（规范性附录）菌体处理B.1水洗用消毒灭菌过的接种针或枪头挑菌落并称取 1 mg2 mg 装有 1000 L 灭菌去离子水的 1.5 mL 离心管中，振荡混匀，10 000 r/min 离心 2 min，弃上清。B.2溶剂处理加入 300 L 灭菌去离子水振荡充分混匀，加入 900 L 无水乙醇振荡充分混匀，10 000 r/min 离心2 min，弃上清留沉淀菌体备用（必要时，再离心一次，尽量去除乙醇和水）。B.3蛋白析出加入 200 L 0.1%TFA 处理后，离心，弃上清液，加入 25 L 70%甲酸，仔细混匀，再加入 25 L乙腈，仔细混匀，在有冰袋控温的条件下超声处理 10 min，10 000 r/min 离心 2 min，取上清液进行质谱分析。SN/T 52042020中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 10 千字2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷印数 1500书号：15517542 定价 16.00 元植物病原细菌筛查 MALDI-TOF MS法行 业 标 准SN/T 52042020*北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址