SNT 5189-2020 鮰类肠败血症检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51892020鮰类肠败血症检疫技术规范Quarantine protocol for Enteric septicemia of channel catfish2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 65.150CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布SN/T 15892020I前 言本文件是根据 GB/T 1.12020 给出的规则起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国厦门海关、福州市疾病预防控制中心。本文件主要起草人：郑腾、张志灯、张体银、唐寰宇、王武军、李宋钰、白泉阳、郭书林、李文最。1SN/T 15892020鮰类肠败血症检疫技术规范1 范围本文件规定了鮰类肠败血症的临床诊断、细菌分离、生化鉴定及聚合酶链式反应鉴定技术。该文件适用于鮰类肠败血症的临床诊断和实验室检疫。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范SC/T 7214 鱼类爱德华氏菌检测方法3 术语、定义本文件没有需要界定的术语和定义。4临床诊断4.1群体检查发病鱼池往往水质较差，病鱼沿池边离群独游，反应迟钝，摄食量下降或不摄食。患病初期，病鱼胸鳍侧常有直径为 3 mm5 mm 的损伤，外部如针状的创伤，并深入到肌肉。有的病鱼头朝上、尾朝下呈垂直状游动，部分病鱼有时呈痉挛式的螺旋状游动，继而死亡。4.2个体检查因鮰鱼规格和个体免疫力等差异，鮰类肠败血症的临床症状不尽相同，主要表现出急性型和慢性型两种形式。急性型又称为肠道败血型，最为常见，死亡率高，主要表现为败血症和肠炎。病鱼体表出现褪色斑，腹部肿胀，有的头部和躯体皮肤溃疡，一侧或两侧眼球突出，肌肉有点状出血或出血斑。鳃丝苍白并有出血点，鳃盖、腹部、颌部和鳍条基部皮肤出现瘀斑和出血，有的则出现白色斑点，肛门红肿，后期病鱼出现全身性水肿。慢性型又称为头盖穿孔型，病菌最初感染部位是鼻根的嗅觉囊，再经嗅觉器官移行到脑，形成肉芽肿性炎症。后期头背颅侧部溃烂形成一个深孔，直到裸露出整个脑组织，形成似“马鞍”状的病灶；随着病情的发展，病灶中心形成溃疡，表现为“头盖穿孔型”病症。2SN/T 158920204.3解剖检查剖开病鱼腹腔，内有大量含血或清亮的液体，流出的腹水不易凝固。肝水肿、质脆，有出血点和灰白色的坏死灶；脾和肾肿大、出血；胃膨大；肠道扩张，肠粘膜水肿、充血、发炎，肠腔内充满气体或淡黄色的水样液体；有时还伴随有套肠出现。脑组织形成肉芽肿，肌肉具弥散性肉芽肿性炎症。4.4临床检查判定群体检查和个体检查中出现以上病症，结合剖检结果，可以初步判断为疑似鮰类肠败血症，需要进一步进行实验室诊断。5实验室诊断5.1设备5.1.1光学显微镜。5.1.2培养箱（28 1 和 37 1）。5.1.3水浴锅。5.1.4高速离心机。5.1.5微量可调移液器。5.1.6PCR 仪。5.1.7电泳仪。5.1.8紫外凝胶成像系统。5.1.9酒精灯。5.2材料和试剂5.2.1水，应符合 GB/T 6682 所规定一级水的要求。5.2.2血液琼脂平板，配制方法见附录 A.1。5.2.3吕氏碱性美蓝染液，配制方法见附录 A.2。5.2.4结晶紫染色液，配制方法见附录 A.3。5.2.5革兰氏碘液，配制方法见附录 A.4。5.2.6沙黄复染液，配制方法见附录 A.5。5.2.7半固体琼脂管，配制方法见附录 A.6。5.2.8四甲基对苯二胺 1%水溶液，配制方法见附录 A.7。5.2.9Hugh-Leifson 培养基，配制方法见附录 A.8。5.2.10磷酸盐缓冲液（PBS），配制方法见附录 A.9。5.2.11TE 缓冲液（pH 8.0）配制方法见附录 A.10。5.2.12十二烷基硫酸钠（SDS）。5.2.13蛋白酶 K。5.2.14氯化钠（NaCl）。5.2.15十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）。5.2.16氯仿。5.2.17异戊醇。5.2.18水饱和酚。5.2.1970%乙醇。5.2.20Taq DNA 聚合酶。3SN/T 158920205.2.21脱氧核苷酸三磷酸 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。5.2.22引物（Primer）：10 moL/L。根据鮰鱼爱德华氏菌酶表达蛋白基因（Eip）序列设计，扩增长度为 276 bp。上游引物 ESC-CM3：5-TCA TCA CAT CAT CTA GCG ATT-3下游引物 ESC-CM4：5-CTT TAC ACA GAT AGG CGA TAC-35.2.23琼脂糖（电泳纯）。5.2.24TAE 电泳缓冲液，配制方法见附录 A.11。5.2.25上样缓冲液，配制方法见附录 A.12。5.2.26DNA 相对分子质量标准物 Marker，推荐使用 100 bp DNA ladder。5.2.27DNA 纯化回收试剂盒。5.2.28鮰爱德华氏菌，菌种保藏编号为 ATCC 33202。5.3样品的采集样品的采集和运输按 SC/T 7103 的规定执行。5.4细菌的分离和鉴定5.4.1样品的处理无临床症状鱼可以无菌采集其肠、肾、肝和脑等内脏器官作为样品，也可直接采集病灶组织作为样品，样品采用无菌生理盐水冲洗并捣碎后进行分离培养。对于体表有临床症状的鱼，可以采用无菌棉拭子或经灭菌后的接种环插入病灶深处的组织取样。5.4.2细菌的分离将样品按常规方法划线接种于血液琼脂平板（配制方法见附录A.1），28 1 下培养24 h48 h。挑取圆形、灰白色、边缘整齐、湿润、呈半透明状的单个优势菌落在血液琼脂平板上再次划线分离纯化。5.4.3染色及形态学观察5.4.3.1病料涂片的美兰染色取病鱼的肾、肝和脑等组织进行涂片，在酒精灯火焰上固定，冷却后用吕氏碱性美蓝染液（配制方法见附录 A.2）染色 1 min3 min，水洗，待干后镜检。5.4.3.2培养物涂片的革兰氏染色培养物涂片后在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液（配制方法见附录A.3），染色1 min后水洗。再滴加革兰氏碘液（配制方法见附录 A.4），作用 1 min 后水洗。滴加 95%乙醇脱色约 30 s；或将 95%乙醇滴满整个涂片后立即倾去，再用 95%乙醇滴满整个涂片，脱色 10 s。水洗，滴加沙黄复染液（配制方法见附录 A.5）复染 1 min。水洗，待干后镜检。5.4.3.3菌体形态鮰爱德华氏菌革兰氏染色阴性，呈杆状，多为单个存在，无芽胞，无鞭毛。5.4.4生理生化试验5.4.4.1运动性试验将分离菌穿刺接种于半固体琼脂（配制方法见附录 A.6）两管，分别置 28 1 和 37 1 4SN/T 15892020下培养 24 h。如分离菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性；如分离菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，为运动性阴性。5.4.4.2氧化酶试验吸取四甲基对苯二胺 1%水溶液（配制方法见附录 A.7）滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色或深紫色的为阳性，不变色的为阴性。5.4.4.3葡萄糖氧化与发酵（O/F）试验挑取分离菌穿刺并划线于 Hugh-Leifson 培养基（配制方法见附录 A.8）上，于 28 1 下培养18 h24 h，如果开口管和封口管内的培养基都产酸（变黄）则分离菌为发酵型（F），如果开口管变黄色而封口管不变色则为氧化型（O）。5.4.4.4其他生化试验镜检观察符合 5.4.3.3 的分离菌，当满足以下条件时：运动性检查表现为 28 下为阳性且 37 下为阴性；氧化酶试验为阴性；O/F 试验为发酵型，分离菌可以鉴定为肠杆菌科。肠杆菌科的分离菌可以按 SC/T 7014 和 SC/T 7214 的规定开展鮰爱德华氏菌的生化特性检测（参见附录 B）。5.4.4.5判定分离菌既符合肠杆菌科特性，又符合附录 B 结果，则分离菌鉴定为鮰爱德华氏菌。如果是部分指标符合应进一步采用 PCR 进行鉴定。5.4.5聚合酶链式反应（PCR）5.4.5.1DNA 提取可以取鱼的脑髓、肝脏、脾脏或肾脏，按 1：10（W/V）加入 PBS 缓冲液（配制方法见附录 A.9），匀浆后作为样品，12 000 r/min 离心 1 min，倒去上清液；也可以从普通营养琼脂平板上挑取经纯培养的可疑单菌落作为样品，悬浮在 1 mL 的 PBS 缓冲液中，12 000 r/min 离心 1 min，倒去上清液。在沉淀中加入 567 L 的 TE 缓冲液（pH 8.0）（配制方法见附录 A.10），混匀后，加入 30 L 的 10%SDS 和 3 L蛋白酶 K（20 mg/L），混匀。56 下温浴 1 h 后，加入 100 L 的 NaCl（5 mol/L），混匀。加入 80 L CTAB/NaCl 溶液（10%CTAB 和 0.7 mol/L NaCl），混匀。65 下温浴 10 min 后，加等体积氯仿/异戊醇（体积比为 24：1），混匀，12 000 r/min 离心 10 min，取上清液，加等体积的酚/氯仿/异戊醇（体积比为25：24：1），混匀，12 000 r/min离心10 min，取上清加0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，12 000 r/min离心 10 min，取沉淀，用 70%乙醇清洗两次，干燥，加 100 L 的 TE 缓冲液（pH 8.0）溶解。也可使用等效的商品化 DNA 提取试验盒。5.4.5.2PCR 扩增PCR 反应体系包括 10PCR 缓冲液 2.5 L、2.5 mmol/L 的 dNTP 0.5 L、10 mol/L 上游和下游引物各 0.5 L、5 L 模板 DNA、5U/L 的 Taq DNA 聚合酶 0.5 L，补充水至 25 L。PCR 反应条件为：94 预变性 5 min，之后 94 变性 30 s，55 退火 30 s，72 延伸 45 s，共 35 个循环；72 补充延伸 10 min，4 保温。以鮰爱德华氏菌标准株作为阳性对照，以大肠杆菌作为阴性对照，用水作为空白对照。也可使用等效的商品化 PCR 扩增试验盒。5.4.5.3琼脂糖凝胶电泳用 TAE 电泳缓冲液（配制方法见附录 A.11）配制 2%的琼脂糖凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使5SN/T 15892020电泳缓冲液刚好淹没胶面。将 6 L 样品和 1 L 上样缓冲液（配制方法见附录 A.12）按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用 DNA 相对分子质量标准物 Marker 作对照。5 V/cm 电泳约 0.5 h，当指示剂到达底部时停止。5.4.6测序用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后，如出现一条大小约 276 bp 的DNA 片段，应对其切胶回收后进行测序，参考序列参见附录 C.1。5.4.7结果判定经核酸扩增电泳后阳性对照会出现一条大小约 276 bp 的 DNA 片段，而阴性对照和空白对照没有该核酸条带。待检样品经核酸扩增电泳后，在阳性对照相应位置上有条带并经测序验证者为阳性。无条带或条带的大小不是 276 bp 的为阴性。6综合判定结合发病症状和病理变化，初判为疑似鮰类肠败血症。需采样进行细菌分离、镜检、生化鉴定和聚合酶链式反应。经细菌分离、镜检和生化鉴定和/或经聚合酶链式反应扩增出 276 bp 片段并经测序验证判为阳性，判定为鮰类肠败血症；无临床症状和病理变化，但经聚合酶链式反应扩增出 276 bp 片段并经测序验证判为阳性，可判定为携带鮰爱德华氏菌。6SN/T 15892020附 录 A（规范性）试剂配制A.1血液琼脂平板的配制蛋白胨 10 g牛肉高 5 g 氯化钠 5 g 琼脂 10 g20 g水 1 000 mL煮沸至充分溶解，121 高