中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5197—2019牛结节疹病毒荧光定量PCR操作规程QuarantineprotocolforrealtimePCRoflumpyskindiseasevirus2019-12-27发布2020-07-01实施中华人民共和国海关总署发布ICS11.220B41ISN/T5197—2019前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆海关。本标准主要起草人：聂福平、李应国、王昱、杨俊、王国民、李贤良、张雷、史梅梅、吴蕊。1SN/T5197—2019牛结节疹病毒荧光定量PCR操作规程1范围本标准规定了牛结节疹病毒的荧光定量PCR检测方法。本标准适用于牛结节疹病毒核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3缩略语下列缩略语适用于本文件。Bp：碱基对（basepair）CPE：细胞病变效应法（cytopathiceffect）Ct：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）LSDV：牛结节疹病毒（lumpyskindiseasevirus）PBS：磷酸盐缓冲盐水（phosphatebufferedsaline）PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction）Taq酶：DNA聚合酶（TaqDNApolymerase）4原理采用TaqMan荧光定量PCR方法，通过比对牛结节疹病毒、山羊痘病毒和绵羊痘病毒的保守基因，针对ITR区域设计一对仅在牛结节疹病毒基因保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记MGB探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团（R），3’端标记的MGB荧光素（Q）在近距离内能吸收5’端荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。反应在退火时，引物和探针同时与目的基因片段结合，探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。2SN/T5197—20195设备和试剂5.1主要仪器和设备5.1.1荧光定量PCR仪。5.1.2低温高速离心机、微量高速...
