SNT 4073-2014 芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法.pdf

SN/T4073-20145.3特异性引物的PCR初筛提取可疑样品DNA,采用特异性引物Xcml/Xcm2进行PCR检测。设阳性对照、阴性对照和空白对照，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。具体操作和判定见附录C。5.4细菌分离培养半选择性培养基NCTM3分离，取疑似症状的样品（参见附录A),用清水冲洗干净，晾干后用灭菌的解剖刀在病健交界处取一小块病变组织，悬浮于少量无菌水中，用无菌玻棒挤压，然后用接菌环蘸取菌悬液，在NCTM3培养基（配制方法见附录B)、平皿上划线分离，28下恒温培养5d。挑取疑似单菌落（圆形，乳白色，黏液状，中央隆起，边缘清晰，大小3.0mm4mm),划线纯化四次后备用。5.5分离菌株特异性引物PCR扩增确认采用特异性引物Xcml/Xcm2对分离疑似菌株进行PCR检测。设阳性对照、阴性对照和空白对照，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。具体操作和判定见附录C6结果判定6.1在5.3特异性引物的PCR初筛中，若出现阴性结果，则判定为样品未携带芒果细菌性黑斑病菌，若出现阳性结果，继续5.4细菌分离试验，阳性、阴性结果的判定见附录C。6.2在5.4细菌分离的基础上，若未出现疑似菌落，则判定样品未携带芒果细菌性黑斑病菌，若出现疑似菌落，则需5.5特异性引物PCR扩增继续判定。6.3在5.5分离菌株特异性引物PCR扩增确认中，若出现阳性结果，则判定为样品带有芒果细菌性黑斑病菌：若出现阴性结果，判定为样品未携带芒果细菌性黑斑病菌。阳性、阴性结果的判定见附录C。7样品保存7.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出的芒果细菌性过斑病菌的样品应保存于一20冰箱中，以备复核。该类样品保存期满店应经高压灭菌杀死病菌后方可做丢弃处理。7.2菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为芒果细菌性过斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于NA培养基斜面上，28培养48h,然后4冰箱保存，或液体培养至对数生长期，加入20%灭菌甘油并混匀，一80长期保存或用安瓿管冷冻干燥长期保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。7.3结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。2SN/T4073-2014附录A(资料性附录)芒果细菌性黑斑病菌相关资料A.1分类地位芒果细菌性黑斑病菌 Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae(Patel et al.)Robbs et al.,变形菌门(Proteobacteria)、Y-变形菌纲(Gammaproteobacteria)黄单胞菌目(Xanthomonadales)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、黑腐黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris)、黑腐黄单胞杆菌芒果致病变种(Xanthomonas cam pestris pv.mangiferaeindicae)。黑腐黄单胞杆菌(X.campestris)有很多不同的致病变种，根据不同的寄主大约有70多种致病变种，如感染十字花科的 X.campestris pv.Campestris,感染葡萄的 X.campestris pv.Vitiscarnosae等。A.2地理分布亚洲：印度，巴基斯坦，马来西亚，日本。我国分布在广东、广西、云南、福建和台湾。非洲：南非，苏丹，埃及，马拉维共和国，刚果，莫桑比克，索马里，摩洛哥大洋洲：澳大利亚。北美洲：多米尼加共和国。南美洲：巴西，巴拉圭，法属圭亚那。A.3寄主范围自然条件下侵染芒果 Mangifera indica、腰果Anacardium occidentale、巴西胡椒 Schinusterebenthifolius,加椰芒果 Spondias cytherea、槟榔青 Spondias monbin 等漆树科 Anacardiaceae植物。人工接种可侵染野芒果 Spodias mangifera Bignonia chamberlaynii等。A.4细菌学性状该菌为短杆状，有15根极生鞭毛，革兰氏染色反应阴性。不产生芽孢，无荚膜，多数单排列，鞭毛单根极生。NA平板培养72h,菌落圆形，乳白色，稍隆起，表面光滑，有光泽，边缘完整，大小1.0mm1.5mm。菌体接种于NA液体培养基置于36下不能生长，培养液澄清。在22下培养，菌体能生长，培养液稍混浊，在2732下培养，生长良好，培养液混浊不透明。A.5生物学特性病菌潜伏在病叶、病枝条、病果等病组织中越冬，是主要的初侵染源。次年春季在温湿度适宜的条件下，病部溢出菌脓，借风雨、流水或昆虫传播，从伤口和水孔等自然孔侵人，初侵染发病后病部又溢出菌脓，经传播不断进行再侵染。此病全年均可发生。高温、及暴风雨为促进病害主要因子。3