腹腔注射α-半乳糖苷神经酰...自然杀伤T细胞及亚群的影响_彭楠.pdf

安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）腹腔注射-半乳糖苷神经酰胺对小鼠肺恒定自然杀伤T细胞及亚群的影响彭楠1，张景楠2，陈俊玉1，滕景芳2，孟明2，曹彩霞3，王彦1作者单位：1河北大学临床医学院、河北大学附属医院检验科，河北 保定071000；2河北大学基础医学院，河北 保定071000；3保定市中心血站，河北 保定071000通信作者：王彦，男，主任技师，硕士生导师，研究方向为临床检验诊断学，Email：基金项目：国家自然科学基金面上项目（81771755）摘要：目的 探讨腹腔注射-半乳糖苷神经酰胺（-GalCer）对小鼠肺恒定自然杀伤 T细胞（iNKT）、细胞亚群及外周血细胞因子的影响，从而为治疗相关肺部疾病提供基础研究数据。方法 60只68周龄雄性C57BL/6 小鼠，采用随机数字表法分为-GalCer干预组和正常对照组，每组30只，选择不同时间点观察干预组与对照组小鼠肺iNKT 细胞、亚群及外周血细胞因子的变化。结果 组间比较发现，与对照组（3.490.25）%相比，腹腔注射-GalCer可引起肺脏iNKT细胞频率及亚群的变化，差异有统计学意义（P0.05）。-GalCer 干预组肺 iNKT 细胞频率前 2 d（6.560.05）%明显升高而后 d6（2.560.08）%、d8（2.640.14）%、d10（2.370.24）%降低（P0.05）。iNKT 1细胞频率低于对照组且呈降低的趋势（P0.05）。iNKT 2细胞频率高于对照组在第4天肺部iNKT2细胞频率达到峰值，随后降低（P0.05），与第2天相比，第4、6、8、10天iNKT17细胞频率均显著升高（P0.05）。组间比较发现，干预组与对照组外周血血清IFN-、IL-4、IL-17A浓度比较，差异有统计学意义，-GalCer干预组在不同时间点IFN-、IL-4、IL-17A 浓度比较，差异有统计学意义，与第2天相比，IFN-、IL-4水平于第6天、第8天均降低（P0.05）；IL-17A 水平于第6天降低（P0.05）。-GalCer干预组的IFN-水平与对照组相比均有明显升高，差异有统计学意义（P0.05）；除第8天外，-GalCer干预组的IL-4水平与对照组比较，差异有统计学意义（P0.05）；第2天、第8天-GalCer干预组的IL-17A水平均低于对照组，差异有统计学意义（P0.05）。结论 腹腔注射-GalCer对小鼠肺组织 iNKT细胞和亚群有不同的激活效应；iNKT细胞激活后，会由脉管系统迁入间质；腹腔注射-GalCer可诱导血清细胞因子的变化，提示-GalCer注射可影响机体免疫功能。关键词：半乳糖神经酰胺类；腹腔注射；恒定自然杀伤T细胞；恒定自然杀伤T细胞亚群Effects of intraperitoneal injection of-GalCer on pulmonary iNKT cells and subsetsPENG Nan1,ZHANG Jingnan2,CHEN Junyu 1,TENG Jingfang 2,MENG Ming2,CAO Caixia3,WANG Yan1Author Affiliations:1Department of Laboratory Medicine,Affiliated Hospital of Hebei University,Hebei University,Baoding,Hebei 071000,China;2College of Basic Medicine,Hebei University,Baoding,Hebei 071000,China;3Baoding Center Blood Bank,Baoding,Hebei 071000,ChinaAbstract：Objective To explore the effects of-galactosylceramide(-GalCer)treatment at different time on iNKT cells,cell subsets and peripheral blood cytokines of mouse lung,so as to provide basic research data for the treatment of related lung diseases.Methods Sixty C57BL/6 male mice aged 6-8 weeks were randomly divided into-GalCer intervention group and control group,with 30 mice in each group.Changes of iNKT cells,cell subsets and cytokines in peripheral blood of mice in-GalCer intervention group and control group were observed at different time.Results Comparison between groups found that intraperitoneal injection-GalCer could cause changes of lung iNKT cells frequency and subsets compared with the control group(3.490.25)%,and the difference was statistically significant(P0.05).The frequency of lung iNKT cells increased significantly in the first 2 days(6.560.05)%and then decreased d6(2.560.08)%,d8(2.640.14)%,d10(2.370.24)%(P0.05).The frequency of lung iNKT 1 cells in-GalCer intervention group was lower than that in the control group(P0.05).The iNKT 2 cell frequency was higher than the control lung,iNKT2 cell frequency peaked on day 4 and subsequently decreased(P0.05),and the iNKT17 cell frequency was significantly higher on days 4,6,8,and 10 compared to day 2(P0.05).Comparison between groups found that peripheral serum IFN-,IL-4 and IL-17A showed IFN-,IL-4 and IL-17A concentrations at different time points,IFN-and IL-4 levels decreased on day 6 and 8(P0.05)and I L-17A levels 药学研究引用本文：彭楠，张景楠，陈俊玉，等.腹腔注射-半乳糖苷神经酰胺对小鼠肺恒定自然杀伤T细胞及亚群的影响J.安徽医药，2023，27（8）：1492-1496.DOI：10.3969/j.issn.1009-6469.2023.08.003.1492网络首发时间：2023-07-06 13:10:19网络首发地址：https:/ 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）decreased on day 6(P0.05).IFN-levels in-GalCer intervention compared with the control group(P0.05),IL-4 levels except day 8 in-GalCer ntervention(P0.05),and IL-17A was lower than the control group(P0.05).Conclusions Intraperitoneal injection of-GalCer has different activation effects on iNKT1 cells and subsets in mouse lung tissue.iNKT cells migrate from the vasculature to the interstitium after activation.The intraperitoneal injection of-GalCer can induce changes in serum cytokines,suggesting that-GalCer injection can affect the bodys immune function.Key words：Galactosylceramides;Intraperitoneal injection;Invariant nature kiler T cell;Invariant nature kiler T cell subsets恒定自然杀伤 T 细胞（invariant nature kiler T cell，iNKT）是 T淋巴细胞中一个独特的亚群，可识别 CD1d分子呈递的脂类抗原。活化后分泌多种细胞因子，直接或间接参与各项机体免疫反应1。iNKT细胞在胸腺中分化成不同的亚群，包括iNKT1主要分泌干扰素-（IFN-）、iNKT2 主要分泌白细胞介素-4（IL-4）、iNKT17 主要分泌白细胞介素-17A（IL-17A）2。最新研究证明，特异性激活iNKT 细胞亚群，可以更有效地发挥其免疫调节和治疗的作用，在感染、肿瘤等疾病中，我们希望iNKT细胞产生促炎性因子的作用，而在自身免疫性疾病时，我们更希望激活 iNKT 细胞的抗炎性免疫反应3-4。-半乳糖苷神经酰胺（-GalCer）是iNKT细胞特异性激活剂，是已知的最有效的iNKT细胞选择性抗原5。但是大剂量的-GalCer刺激，会使iNKT细胞在数月内进入免疫失能状态，对后续的抗原刺激反应减弱或无应答6。在小鼠肺中，iNKT细胞在肺脉管系统和间质组织间建立了非循环群体7。大多数 iNKT1 和iNKT2细胞存在于脉管系统中，iNKT17 细胞主要存在于组织间质8-9。呼吸系统的免疫系统承受着巨大的负荷和种类繁多的外来抗原，引发多种免疫反应10。因此研究腹腔注射-GalCer对小鼠肺iNKT细胞、细胞亚群及外周血细胞因子的影响，观察其动态变化，从而为后续获得临床免疫细胞治疗提供基础研究数据，同时也可为疫苗的研发提供新的思路。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物68周龄的雄性C57BL/6J小鼠，引入SPF 级动物室后，进行1周适应性饲养，随后进行实验。该实验已通过河北大学动物福利伦理委员会的批准且在操作过程中严格遵守 实验动物保护条例。1.1.2主要试剂与仪器-GalCer（北京 AdipoGen）；戊巴比妥钠、小鼠组织淋巴细胞分离液、0.5 mol/L EDTA（北京索莱宝）；Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer（美国 Invitrogen）；FITC Hamster Anti-Mouse TCR-Chain、AlexaFluor647-mouse anti-PLZF、BV421 Mouse Anti-Mouse