抗菌肽-Mt6的理化特性和...真菌药物对白色念珠菌的作用_黄敏慧.pdf

基础研究抗菌肽 的理化特性和抗菌活性及联合抗真菌药物对白色念珠菌的作用黄敏慧，曾晔，张迎春，李彩多，吴建伟，陈峥宏，王涛，（贵州医科大学 基础医学院，贵州 贵阳；贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室，贵州 贵阳）摘 要目的 探讨抗菌肽（）的理化特性、抗菌活性及联合抗真菌药物对白色念珠菌（）的作用。方法 以家蝇抗真菌肽（）为模板，采用氨基酸残基替换法设计，并以生物信息学方法分析其理化特性；挑取对数生长期 、金黄色葡萄球菌（）、枯草杆菌（）、大肠埃希菌（）、铜绿假单胞菌（）、甲型副伤寒沙门菌（）及肺炎克雷伯菌（）菌落制备细胞悬液，取菌液 和相同体积不同终浓度（.）的 稀释液混匀，采用微量肉汤稀释法检测 对上述各菌属的最小抑菌浓度（）、最小杀真菌浓度（）及最小杀细菌浓度（）；取（.）的 菌液 和相同体积不同终浓度（.）的氟康唑（）、两性霉素（）、伊曲康唑（）及 氟胞嘧啶（）药物稀释液混匀，采用微量肉汤稀释法检测上述各药物对 的 和；采用棋盘格法检测 分别与、联合使用时对 的体外抑制活性，并以部分抑菌浓度指数（）判定联合效应。结果 为带有 个正电荷数、疏水性为.、螺旋占比 的两亲性多肽；对 的 为.，对所检测细菌均有抗菌作用，对 、及 的 为.，对 、的 为 .；与、及 联合时，值分别为.、.及.，表现为协同效应；与 联合时，值为.，为相加效应。结论 与模板肽 相比，的理化性质得到优化，抗菌活性和抗菌谱增强，与抗真菌药、及 联用可增强各药物对 的抑杀效果。关键词白色念珠菌；家蝇抗真菌肽；分子改造；抗菌肽；抗菌活性；联合抗菌实验中图分类号.文献标识码 文章编号（）：，（，；，），（），（），第 卷 第 期 年 月 贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目国家自然科学基金（）；贵州省科技计划项目（黔科合平台人才，黔科合支撑）贵州医科大学 级硕士研究生通信作者：引用本文：黄敏慧，曾晔，张迎春，等 抗菌肽 的理化特性和抗菌活性及联合抗真菌药物对白色念珠菌的作用 贵州医科大学学报，（）：，（），（），（），（），（），（），（）；（）（），（）（）（）（），（），（），（），（），；，；.，（，）；由于抗菌药物的不规范使用，微生物耐药性已成为当今威胁公共卫生健康的重要挑战之一。据预测，如果不加以控制，到 年因微生物耐药导致的死亡人数每年可多达 万人。研究表明，目前新开发的抗菌药临床效果并不显著，不足以应对当前微生物耐药性的挑战，因此寻找新型抗微生物药物或治疗方法已迫在眉睫。抗菌肽（，）是生物体抵御外界病原体感染的小分子功能多肽，由于其具有抗细菌、真菌以及病毒等广谱的生物学活性且不易产生耐药等特点引起了广泛关注。家蝇抗真菌肽（，）是家蝇幼虫特有，本课题组前期研究表明其对白念珠菌（，）等真菌、病毒和肿瘤细胞均具有抑制活性，但与传统抗菌药物相比 存在抗菌活性相对不高的弱点，限制了其临床应用。目前，以天然活性 为模板进行结构优化是获得高抗菌活性衍生肽的主要策略。研究还发现，将 与临床常用抗菌药物联用不但能提高抗菌效果，还可以减少抗菌药物的用量，对降低微生物耐药率有重要意义，但 与传统药物的联合抗菌作用研究主要集中在抗细菌活性方面，对于抗真菌作用的研究鲜见报道。本研究通过对 的氨基酸分子进行替换、获得衍生肽，分析其对 以及多种革兰阳性菌（，）和革兰阴性菌（，）的抗菌活性；并将 与 种临床常用抗真菌药物分别进行联合抗菌试验，检测 联合不同抗真菌药对 的体外抑菌效果，为开发新型抗菌药物及疗法提供一定的理论和实验基础。贵 州 医 科 大 学 学 报 卷 材料与方法.实验材料.菌株来源 、金黄色葡 萄 球 菌（，）、枯草杆菌（）、大肠埃希菌（，）、铜绿假单胞菌（，）、甲型副伤寒沙门菌（，）、肺炎克雷伯菌（，）由贵州医科大学病原生物学微生物教研室提供。.主要试剂及仪器 两性霉素（，）、氟康唑（，）、伊曲康唑（，）、氟胞嘧啶（，），沙氏葡萄糖琼脂培养基（，）、水解酪蛋白琼脂培养基（，）及水解酪蛋白肉汤培养基（，；北京），干粉培养基（上海），磷酸盐缓冲溶液（，）和碳酸氢钠干粉（北京），（吗啡啉）丙磺酸（上海）；双面垂直流超净工作台（苏州净化）、台式高速冷冻离心机（德国）、智能生化培养箱（宁波普朗特）、生物安全柜（青岛海尔）、全自动高压蒸汽灭菌器（厦门深华）。.研究方法.分子设计、生物信息学分析及化学合成 以 的氨基酸序列为模板，使用赖氨酸（，）替换 序列中的谷氨酸（，）、天冬酰胺（，）来增强衍生肽的阳离子性；以亮氨酸（，）以及色氨酸（，）替换谷氨酰胺（，）增强衍生肽的疏水性。利用 网站软件（：）预测 的正电荷、疏水性等理化性质，网站软件（：）预测 的螺旋轮投影，（：）网站的 软件计算 中螺旋所占比例。模板肽及衍生肽均委托生工生物（上海）工程股份有限公司采用 芴甲氧羰基固相合成法合成，高效液相色谱纯化、液相色谱 质谱验证，多肽合成纯度。.的抗菌活性检测挑取对数生长期的 、菌落置于 中制备成细胞悬液，用 液体培养基将 菌液浓度调整至（.），用 将 、菌液浓度调整至.；取相同体积的菌液 和不同终浓度 稀释液（.）于 孔板中混匀，孵育，肉眼观察无菌生长孔对应的浓度为衍生肽的最小抑菌浓度（，）；取 试验中判定为无菌生长的培养液，真菌接种于 平板，细菌接种于 平板后，置 培养 ，观察生长现象，以无菌生长所对应的最低药物浓度分别为最小杀真菌浓度（，）和最小杀细菌浓度（，），每组实验重复 次；同时设 对照组及阴性对照组。.、以及 对 的 值测定 参考文献 方法，取浓度为（.）的 菌液 和相同体积不同终浓度.的药物稀释液于 孔板中混匀，孵育 ，肉眼观察无菌生长孔对应的浓度为；取 试验中判定无菌生长的培养液接种于 平板，培养 后观察生长现象，以无菌生长所对应的最低药物浓度为，实验重复 次。.分别与、联合用药效果检测参考文献方法并稍作修改。采用 棋盘，分别与、及 联合使用，实验步骤如图 所示（以 和 联合使用为例），每孔分别加（.）的 菌液 和、（或、）稀释液各，使得每一横行 的终浓度为 、及 ，同时每一纵列（或、）的终浓度不变；每一纵列（或、）的终浓度为 、及 ，同时每一横行 的终浓度不变。混匀后于 恒温孵育 。期黄敏慧等 抗菌肽 的理化特性和抗菌活性及联合抗真菌药物对白色念珠菌的作用注：表示终浓度为 、的抗真菌药物；表示终浓度为 、及 的 稀释液。图 和不同抗真菌药物联合抗菌的实验示意 .联合用药效果判定 根据部分抑菌浓度指数 ，；（药物 联合使用时 值 药物 单用时 值）（药物 在联合使用时 药物 在单用时 值）判断联合用药效果，标准如下：.时，联合用药效果为协同；.时，联合用药效果为相加；时，联合用药效果为无关；当 时，联合用药效果为拮抗。结果.生物信息学结果生物信息学软件分析结果显示，使用、替换相应氨基酸获得衍生肽（表）：与模板肽 相比，的正电荷数由 增加到，疏水性由.增加到.，结构中的 螺旋占比有所增加至，不稳定指数降低至.（表）；螺旋轮结构预测结果显示，为两亲性结构（图）。表 和 的氨基酸序列 氨基酸序列注：表中标红的部分为替换后的氨基酸。表 和 理化性质参数 理论分子量 长度 正电荷 疏水性 不稳定系数 螺旋度 .注：字母表示氨基酸的缩写，其中 为丙氨酸，为天冬氨酸，为谷氨酸，为苯丙氨酸，为异亮氨酸，为赖氨酸，为亮氨酸，为甲硫氨酸，为谷氨酰胺，为丝氨酸，为苏氨酸，为色氨酸；蓝色表示带正电的亲水性氨基酸氨基，红色表示带负电的氨基酸残基，黄色表示强疏水性氨基酸，灰色表示疏水性氨基酸，紫色表示不带电的氨基酸残基；箭头表示的是疏水力距的大小。图 和 的螺旋轮结构 贵 州 医 科 大 学 学 报 卷.抗菌活性 生物学活性检测结果显示（表），与模板肽 相比，对 、及 均表现出明显的抗菌活性，其中对 抑制活性最强（为.、为.），且明显优于模板肽。表 和 对不同微生物的抗菌活性 菌属（）（）.注：表示无抗菌活性。.、及 对 的抑制活性微量肉汤稀释法检测结果显示（表），、及 抗 的 分别为.、.、.及.，值分别为.、.、.及.。表 、及 对 的 和 ，抗真菌药抑制活性（）.分别与、联合使用的抗 效果 与药物联合药敏实验结果显示（表），与 联合使用抗 时，值为.，表现为相加效应；与 联合使用时，值为.，表现为协同效应；与 联合使用时，值为.，表现为协同效应；与 联合使用时，值为.，表现为协同效应。表 与常用抗真菌药物联合的抗 效果 联合方式药物（）单用联合 与 与 与 与 讨论 作为具有抗细菌、真菌等多种生物学功能的小分子功能多肽，因其独特的作用机制，通常不会诱导病原体产生耐药性，具有被开发成新型抗菌药物的潜力。但大多数天然 由于抗菌活性低于传统抗菌药物，以及药代动力学较差等问题，限制了其开发与利用，因此需要通过分子改造以获得优良的 分子。氨基酸残基替换法是目前 分子改造方法中较为常用的一种，以天然活性 的氨基酸序列为模板，通过用优势氨基酸在序列中特定位置的替换来优化影响 抗菌活性的阳离子性、疏水性、双亲性及 螺旋等理化性质和结构参数，从而提高 的生物学活性。本研究中以 的氨基酸序列为模板，采用氨基酸残基替换法对其结构及理化性质进行优化后得到 条全新多肽，生物信息学分析结果显示，与模板肽 相比，的正电荷数、疏水性、螺旋以及稳定性均增加，说明经分子改造所获的 的理化性质优于模板肽；抗菌活性实验结果显示，对 的抗菌活性明显强于模板肽，对、及 等 种不同的 和 细菌均表现出明显的抗菌活性，而模板肽 只对真菌 具有抑制活性，对以上细菌均无抑制作用，结果表明衍生肽 除了具有抗真菌活性外还具有抗细菌活性，其抗菌活性及抗菌谱较模板肽 均显著增强，提示 期黄敏慧等 抗菌肽 的理化特性和抗菌活性及联合抗真菌药物对白色念珠菌的作用 具有进一步被开发成抗菌药物的潜力。作为一类可定植于人体口腔、阴道等部位的机会致病性真菌，可导致机体黏膜感染甚至深入内部组织引起侵袭性念珠菌病。唑类、多烯类及棘白菌素类是目前临床常用的抗真菌药物，然而由于这些抗真菌治疗药物长期的使用使得临床 耐药问题亟待解决。等研究表明，将 和 分别与头孢他啶、妥布霉素、环丙沙星、多尼培南及粘菌素联合使用，抗鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌时呈协同或相加效应，在低浓度下对鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌及其多重耐药菌株均有明显抑制作用。此外，等将 与万古霉素和替考拉宁联合使用后，对肺炎克雷伯菌耐药株表现出协同抑制效应，抗菌效果显著增强。本研究结果显示，与、分别联用时，抗 效果均呈协同效应，与 联用时呈相加效应，且 与、联用抗 的 值与单用时 值相比，均有不同程度的减低，与抗菌药物在较低浓度下就能对 产生良好的抑制作用，表明 与传统抗真菌药物联用能增强抗菌效果，这一结果提示 与抗真菌药物联用对减少临床抗菌药物用量、降低药物相关耐药性的产生具有一定意义，但具体作用机制还有待深入探究。综上所述，经分子改造所获得的 的抗菌活性和抗菌谱较模板肽 明显增强，与临床常用抗真菌药物、联用可增强抗菌药物对 的抑杀作用，提示衍生肽 具有成为新型临床抗菌药物候选分子的潜力。参考文献 ，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，：，（）：，（）：，：朱志翠，邓思波，张迎春，等 家蝇抗菌肽 体外抗甲型流感病毒活性及机制研究 中国人兽共患病学报，（）：吴坤，张迎春，邓思波，等 家蝇抗真菌肽 对人肝癌细胞 的影响 贵州医科大学学报，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，贵 州 医 科 大 学 学 报 卷 ，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（，），（）：，：，（）：，（）；，（）：（收稿，修回）中文编辑 严 征 英文编辑 赵 毅（上接第 页），：，（）：，（）：，（）：（收稿，修回）中文编辑 严 征 英文编辑 丁廷森 期黄敏慧等 抗菌肽 的理化特性和抗菌活性及联合抗真菌药物对白色念珠菌的作用