第六章个别细胞和组织的培养第一页，共七十页。类型：正常细胞培养肿瘤细胞培养第二页，共七十页。第一节正常细胞培养正常细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难。正常细胞难培养的原因是它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格.但只要一切条件适当仍有培养成功可能。第三页，共七十页。一、上皮细胞类培养上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层；培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。第四页，共七十页。上皮细胞培养有三个难点：①需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层那么利于细胞生长；②需求特殊培养基；③与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长，并常压过上皮细胞。纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。第五页，共七十页。(一)表皮细胞培养1．特点：在有胶原的底物上易生长；把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层(用射线照射后)上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低pH、Ca2+的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。向培养基中加氢化可的松(10μg/m1)、10-6M的异丙基肾上腺素(Isoproterenol)和10ng/m1促表皮生长因子(EGF)能促表皮细胞生长。第六页，共七十页。【饲细胞】饲细胞(FeederCells)也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。饲细胞作用：有同化营养液的能力。饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成克隆形成后饲细胞渐第七页，共七十页。饲细胞的制备：(1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%集合时制成细胞悬液，再按103细胞/毫升重新接种培养；(2)在细胞半集合时，准备0.25μg/ml的丝裂霉素，按2ug/105细胞的量参加到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量30～50戈瑞(Gy)；(3)细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时胰蛋白酶消化细胞制成悬液第八页，共七十页。2．表皮细胞培养程序：(1)取材：取外科植皮或手术剩余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5~1cm2小块；(2)EDTA处理：先置入0.02％EDTA中室温置5分钟。第九页，共七十页。(5)温消化：取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30~60分钟；(6)制细胞悬液：用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液；(7)加培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接参加Eagle液和20％小牛血清.(8)培...
