2022年医学专题—大肠杆菌与遗传测序.pptx

第一页，共九十一页。,主要通过检测什么检测大肠杆菌(d chn n jn)：1、菌落数量2、大肠杆菌生成物间接检测(-半乳糖苷酶,-葡萄糖醛酸酶)3、表面抗原4、DNA,主要(zhyo)通过检测什么检测大肠杆菌,第二页，共九十一页。,1、芯片(xn pin)化的大肠杆菌检测法,1.1、在线富集技术在微流控芯片上实现(shxin)低浓度细菌微生物超灵敏检测,背景：由于在水、食品和临床样品病菌的感染剂量可能非常低,为了能够快速测量存在于实际样品中低浓度的病原(bngyun)微生物,科研工作中己经投入了相当大的精力到这一领域。本文通过将壳聚糖(CS)扫集,反转电场堆积和场放大样品堆积多步浓缩方法联合,在芯片上实现了细菌的高效检测。（了解）,第三页，共九十一页。,由于CS（壳聚糖）带有大量正电荷因此常被用于絮凝吸附剂和不同作用的绑定试剂。因为在细菌和病毒细胞外膜表面具有羟基和磷酸根基团,常使其带负电荷,CS与细胞可通过静电作用可使其聚集。并且CS也常作为天然抗菌剂被大量使用。因此,CS的高吸附能力(nngl)可使其用于细菌浓缩,并且作为扫集试剂可以保持细胞的活性。此外,通过将CS扫集、场放大样品堆积和反转电场富集技术联合使用,在微流控芯片上一体化实现了多步浓缩检测方法。（知道）,第四页，共九十一页。,材料和仪器三羟基甲基氨基甲烧(Tris),硼酸,乙二胺四乙酸(EDTA)购买于Aldrich公司(Milwaukee,WI,USA)。壳聚糖,牛璜酸和半胱氨酸购买于上海国药集团。大肠杆菌(d chn n jn)、E.coli)购买于广东微生物种质资源库。所有的实验在自制的微流控-激光诱导焚光检测系统(MCE)上实施。微流控系统主要由上海光谱有限公司提供。(了解),第五页，共九十一页。,细菌悬浮液的准备：大肠杆菌在 LB 培养基 30 度下培养 13 h。在3400 rpm（每分钟转数）离心5min,上清液去除,再次用无菌水对细胞进行清洗,离心,重复(chngf)这个过程5次以去除残留的培养基并且达到清洗细胞的目的。近红外核酸荧光染料SYTO 62用来标记细菌细胞。最后,标记的细菌细胞悬浮在含有牛磺酸的缓冲溶液,浓度约1.0 x107CFU/mL。在每次使用之前,新准备的细胞悬浮液需要漩祸60-90 S以避免细胞聚集。（了解）,第六页，共九十一页。,微流控芯片系统的条件：用于实验的“十字”通道微流控芯片微通道深为25 宽为100 um。分离通道长为50 mm,其他通道与交叉口的距离为10 mm。铂电极作为电源与溶液之间的导电电极。芯片使用之前需要用98%的浓硫酸和去离子水各冲洗10 min。随后,用1 mol/L NaOH冲洗通道20 min,再用去离子水冲洗10 min,最后用运行缓冲溶液清洗10 min。芯片清洗过后,将含有CS（壳聚糖）的分离缓冲芯片对通道进行(jnxng)预涂敷处理。（参考）,第七页，共九十一页。,微流控芯片多步浓缩方法用于细菌(xjn)检测：对于场放大细菌堆积,与运行缓冲溶液相比,细菌细胞应该分散在更低电导率的样品缓冲溶液中。牛磺酸能够使细胞聚集从而改善检测灵敏度,将少量的牛磺酸添加到悬浮液中。下图是芯片电泳五步浓缩过程示意图。通过施加相应的电压对细菌细胞进行在线富集和浓缩。（图）,第八页，共九十一页。,细菌在线富集分离机理示意图。(A)预上样;(B)进样,(C)场放大样品堆集和扫集,(D)反转电场富集,(E)分离。黑色区带代表浓缩的细菌样品,灰色代表样品基质,空白(kngbi)代表含有CS（壳聚糖）的运行缓冲,箭头表示电渗流方向。Analytical Chemistry,2012,84,1687，华东师范大学，王志芳,第九页，共九十一页。,标准条件下多步浓缩富集方法(fngf)对大肠杆菌的定量检测曲线。,第十页，共九十一页。,自然水体中大肠杆菌的检测：由于地表水中细菌的浓度经常30 CFU/mL,具有较高富集倍数的检测方法才能测定河水中的大肠杆菌。此外,因为河水中常含有CO32-、SO4 2-等，运行缓冲的电导率远远低于河水。由于使用的浓缩方法部分是基于(jy)运行缓冲和样品缓冲中不同的电导率,因此必须过滤水样以去除水中含有的离子。此外,经过预富集的细菌水样的浓度必须达到多步浓缩方法的检出限。因此可以通过无菌滤膜过滤预富集水样中的大肠杆菌。,第十一页，共九十一页。,多步浓缩富集方法(fngf)对地表水中大肠杆菌的检测,第十二页，共九十一页。,小结：为了提高检测灵敏度,能够实现实际(shj)样品中低浓度细菌的测定,将堆积、扫集和其它预浓缩方法的联合使用是必要的。我们通过使用微流控芯片展示了多步浓缩方法(CS扫描、反转电场和场放大样品堆积)可以用来加强细菌富集,实现低浓度污染的样品的测定。对比于常用的细菌检测方法,多步方法具有高灵敏度、低样品需耗量和快速分析的优点。（知道）,第十三页，共九十一页。,1.2、纳升级(shng j)液滴阵列实时定量RT-PCR系统的研究 综述：基于平面液滴阵列的微流控系统具有系统简单、成本低廉、液滴操控灵活、适于多步集成操作及液滴后续操作等优点,在微流控系统的实时定量PCR技术显示了广阔的应用前景,尤其是基于液滴的PCR系统。液滴微反应器将反应液分隔在单分散体系中,减少了 PCR歧视及非特异性扩增;反应体积可为纳升至皮升级,与细胞体积相当,能够有效限制内容物的扩散,降低背景对信号的稀释作用;通过不溶相使液滴微反应器与微通道内壁间隔开来,最大限度地减少了通道内壁对试样的吸附,消除了交叉污染。（知道）,第十四页，共九十一页。,背景：MicroRNA(miRNA)是一类非编码的小RNA序列,其长度只有18-25个碱基。越来越多的研究证明,miRN A 在很多基因的表达过程中起到了分子开关的作用,在许多癌症及重大疾病的发生和发展中,miRNA都出现了异常表达现象。因此准确对miRNA进行定量检测具有重要(zhngyo)的生物学和临床意义。（了解）,第十五页，共九十一页。,技术条件：实时定量(反转录)聚合酶链式反应(以下简称qPCR或qRT-PCR)技术是以传统PCR技术为基础建立起来的一种可对原始核酸(包括(boku)DNA和RNA)模板拷贝数进行准确定量分析的一种现代分子生物学检测技术,已经广泛地用于分子诊断,疾病研究,临床医学等领域。qPCR技术遵循传统PCR的扩增原理,不同的是在每一个循环的退火或延伸阶段进行实时荧光检测。根据溶液中模板的原始拷贝数的对数与扩增循环数Ct存在的线性关系,对核酸进行定量分析。实时定量PCR技术具有准确度高,灵敏度高及检测范围宽(超过5个数量级)等特点,因此非常适用于miRNA的定量检测。（知道）,第十六页，共九十一页。,实验材料及试剂：单晶桂片(N111型):上海齐鸣桂材料有限公司,上海。氧化锡铟(ITO)玻璃(b l)(1.1 mm厚,lOohm/m2):深圳莱宝高科技股份有限公司,深圳。AZ4620光胶:安智电子材料公司,苏州。环氧树脂(合众全透明AAA超能胶):浙江黄岩光华胶點剂厂,黄岩。荧光素纳(产品编号:FT0989):上海生工生物工程股份有限公司,上海。氟化铵(NH4F):国药集团化学试别有限公司,上海。氢氧化纳(NaOH):国药集团化学试剂有限公司,上海。浓硫酸(H2SO4):国药集团化学试劍有限公司,上海。氢氟酸(HF):国药集团化学试刻有限公司,上海。硝酸(HN03):国药集团化学试劍有限公司,上海。异辛院:国药集团化学试剖有限公司,上海。无水乙醇(C2H5OH):国药集团化学试剂有限公司,上海。（了解）,第十七页，共九十一页。,实验溶液配制：硅烷化试剩:将OTCS与异辛烷混合作为硅烷化试剂,体积比为0.1%-1%均可,现用现配。芯片刻姓液分别量取HF16mL、NH4F 7.4 g.HNO319.2 mL.去离子水364.8 mL在塑料器皿中混勻,配置成摩尔浓度比HF:NH4F;HNO3为1:0.5:0.75的芯片刻烛液,常温(chngwn)保存,可重复使用。光刻显影液:称取0.7 g NaOH固体溶解于100 mL去离子水中,配置成0.7%NaOH溶液,作为光刻显影液。0.1 M荧光素纳溶液:用于多步加样过程的观察。成熟 miRNA-122(mir-122,UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG)序列来源于 Sanger Center miRBase,由上海吉玛制药技术有限公司(上海)负责合成。2%RNase清除剖(体积比):使用娃哈哈纯净水稀释RNase清除刻,用于芯片及PCR耗材清洁。（了解）,第十八页，共九十一页。,实验芯片：亲水点阵列芯片加工，采用CorelD RAW X3软件绘制芯片掩膜图。硅片为直径76 mm的圆形薄片,每块桂片可加工出7块13X13mm芯片。芯片设计成6 X6点阵(din zhn),点直径为0.5 mm,间距为1.7mm。（参考）,第十九页，共九十一页。,实时定量RT-PCR系统构建：将芯片置于商品化基因扩增仪(MGL96G/Y,杭州朗基科学仪器有限公司)的载物合上,用PCR仪控制热循环温度。将ITO玻璃罩在芯片上方,结合自制的温度控制模块,维持温度恒定,以起到热盖的作用。以汞灯作为荧光激发光源,利用Nikon体视荧光显微镜(SMZ1500,Nikon,Japan)的光路系统采集荧光。用 Labview(Labview 8.0,National Instruments,Austin,USA)程序控制 CCD(电荷耦合器件)和自制的挡光阀,在每个循环退火阶段拍摄(pish)荧光照片。（图）,第二十页，共九十一页。,实时定量RT-PCR系统示意图，浙江大学(zh jin d xu)，张云霞，2013.04,第二十一页，共九十一页。,数据采集处理：采用自编的Labview程序读取各个循环荧光照片(zhopin)上液滴的荧光强度值,得到荧光强度随反应循环数增加的变化曲线。以各条曲线前10个循环荧光强度值Rn的标准偏差的10倍作为阈值,取大于阈值的循环数作为CT(临界循环次数)值。以加入miRNA-122的拷贝数的对数值作为横坐标,CT值为纵坐标拟合出标准曲线。（了解）,第二十二页，共九十一页。,Labview数据采集系统软件(x tn run jin)界面,第二十三页，共九十一页。,芯片清洗及注意：每次使用后,使用医用脱脂棉蘸洗海刻搓洗芯片表面,再分别用去离子水及娃哈哈纯净水冲洗。清洗表面后,将芯片置于2%RNase清除剂中浸泡5min,以减少RNA降解,避免PCR污染。用娃哈哈纯净水冲洗后,在烘箱中65 C-80C烘干30min。清洁后的芯片置于干净(gnjng)的培养皿中,室温存放。实验中经清洗后的芯片不会产生PCR污染,可反复使用。芯片最长使用时间可达一年。本实验全程需佩戴口罩及乳胶手套。芯片硅烷化、光刻及湿法刻烛过程中,使用试刻的挥发性和腐蚀性较强,尽量在通风橱内操作。玻璃研磨过程中要带防护眼镜以保护眼睛。（知道）,第二十四页，共九十一页。,小结：本工作中,我们发展了一种半敞开式的纳升级平面液滴阵列平台,并将其应用于miRNA-122的实时定量RT-PCR检测中。利用(lyng)平面液滴的优势,在经表面修饰的亲水点阵列芯片上,实现了液滴的定位和多步加样操作。该芯片具有加工简单、操作灵活、易于普及等优点,可以作为一种通用型的生物化学反应平台使用。此外,该系统可在试剂消耗、检测通量及系统集成化微型化等方面进一步优化改进,有望在大规模高通量分析领域发挥重要的作用。（知道）,第二十五页，共九十一页。,1.3、基于(jy)纳升级液滴阵列的自动化单细胞实时定量RT-PCR系统的研究,综述：研究基因型与表现型之间的关系是生物学及医学发展的重要环节,以定量测定细胞内各类RNA表达为目标的转录组研究对于基因表达和分子诊断研究尤为重要。同一器官中的所有细胞具有特定的基因型,而细胞个体之间基因表达却有很大差异,这就造成了细胞亚群的分化,并具有不同的生理功能、应激行为及表现型。由于这种细胞异质性的存在,转录组研