紫外吸收(xīshōu)法测定蛋白质含量第一页，共十五页。一、实验(shíyàn)目的学习紫外分光光度法测定(cèdìng)蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用方法。第二页，共十五页。(shíyàn)由于蛋白质中存在着含有(hányǒu)共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。第三页，共十五页。(cáiliào)1．试验材料：待测的蛋白质溶液。2．主要仪器：（1）紫外分光(fēnɡuānɡ)光度计，（2）试管与试管架，（3）刻度吸量管3．试剂：（1）标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。（2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/mL左右的溶液第四页，共十五页。四、操作步骤1．标准曲线制作按下表分别(fēnbié)向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。第五页，共十五页。2．样品测定取待测蛋白质溶液1mL，加入(jiārù)蒸馏水3mL，混匀，按上述方法测定280nm的光密度，并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液的浓度。第六页，共十五页。五、附注(fùzhù)1．在测定工作中，可以利用280nm及260nm的光密度值求出蛋白质的浓度(nóngdù)：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45OD280nm―0.74OD260nm上式中的OD280nm是蛋白质溶液在280nm下测得的光密度，OD260nm是蛋白质溶液在260nm下测得的光密度。第七页，共十五页。2．对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测的蛋白质溶液稀释至光密度在0.2~2.0之间，选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm及260nm处分别测出光密度OD280nm/OD260nm的比值，从下表中查出校正因子“F”值，同时可查出该样品内混杂的核酸的百分含量，将F值代入下述公式(gōngshì)，即可计算出该溶液的蛋白质浓度。蛋白质浓度（mg/mL）=F×OD280nm×D式中：OD280nm为被测溶液在280nm紫外波长下的光密度，D为溶液的稀释倍数。第八页，共十五页。OD280nm/OD260nm校正因子核酸%OD280nm/OD260nm校正因子核酸%1.751.1160.000.8460.6565.501.631.0810.250.8220.6326.001.521.0540.500.8040.6076.501.401.0230.750.7840.5857.001.360.9941.000.7670.5657.51.300.9701.250.7530.5458.001.250.9441.500.7300.5089....
