第一页，共七十四页。第一页，共七十四页。IdentificationofculturedadultratRGCs.Culturedcellswereco-labeledwithanti-Thy-1antibody(A),anti-NF-Lantibody(B),andDAPI(C).(D)Adigitallymergedimagesimultaneouslyrepresentsallthreefluorescentlabels.(E)Thecorrespondingphase-contrastimage.第二页，共七十四页。第二页，共七十四页。免疫荧光染色法用于标记(biāojì)二抗体的荧光素：（1）异硫氰酸荧光素（FITC）发射的荧光波长为490～619（绿色荧光）（2）四乙基罗丹明：荧光波长为540～660（橙红色荧光）（3）DAPI或Hoechst33258:染核，用紫外激发第三页，共七十四页。第三页，共七十四页。1、用95%乙醇固定(gùdìng)细胞10-30分或用冷丙酮固定5～10分。2、用PBS洗3次。3、用PBS配制的1‰Triton10分。用PBS洗3次4、用2%～5%BSA封闭2小时5、加入一抗过夜，PBS洗3次6、加入二抗1～2小时，PBS洗3次7、核复染，荧光显微镜观察。第四页，共七十四页。第四页，共七十四页。一、上皮细胞培养(epithelialculture)上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分(chéngfèn)，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。第五页，共七十四页。第五页，共七十四页。体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能(kěnéng)利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。第六页，共七十四页。第六页，共七十四页。表皮细胞培养1、取材：外科植皮或手术残余皮肤(pífū)小块，早产流产儿皮肤(pífū)更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。6、反复吹打，制成悬液。7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。第七页，共七十四页。第七页，共七十四页。第八页，共...
