01/26/2025RNA第一页，共四十九页。01/26/2025◆人类细胞质RNA提取◆RT-PCR的原理、方法◆琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用主要内容第二页，共四十九页。人类细胞质RNA提取第三页，共四十九页。01/26/2025电泳PCR提取总RNA合成cDNA第一链第四页，共四十九页。01/26/2025真核细胞RNA的种类真核细胞总RNA主要由rRNA〔80-85%〕、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA〔1-5%〕组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一多聚A(PolyA)尾巴。第五页，共四十九页。01/26/2025实验前的准备RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。第六页，共四十九页。01/26/2025常用的RNA酶抑制剂1、焦磷酸二乙酯〔DEPC〕：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，进而使RNA酶失活，有高致癌性。〔实验准备阶段使用〕2、异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。3、RNA酶的蛋白抑制剂〔RNasin〕：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。〔合成cDNA阶段使用〕第七页，共四十九页。01/26/2025实验原理Trizol试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质别离。参加氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保存在水相中，DNA和蛋白质保存在有机相中。转移水相，参加异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。第八页，共四十九页。01/26/2025提取RNA〔一〕、准备试剂•氯仿•异丙醇•75℅乙醇•无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)第九页，共四十九页。01/26/2025提取RNA〔二〕、操作步骤取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约2~3min，用15ml离心管〔4000rpm5min〕收集细胞(同管屡次离心)，弃上清沉淀中参加1mlTRIzol，旋涡震荡10s重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转移至1.5mlEP管，15~30℃放置5min参加0.2ml氯仿，用手摇晃15s，15~30℃放置5min12000rpm离心15min第十页，共四十九页。01/26/2025提取RNA〔二〕、操作步骤小心吸取上清，转移至新的1.5mlEp管，参加等体积的异丙醇，15~30℃放置10min12000rpm离心15min，小心去上清，参加1ml70%乙醇，震荡数秒，8000rpm离心5min小心去上清，室温枯燥5min，参加10ulDEPC水，打匀第十...
