细胞生死状态(zhuàngtài)的鉴定——台盼蓝法第一页，共十四页。掌握(zhǎngwò)血球计数板细胞计数法以及死活细胞鉴定的原理和常用方法。一、实验(shíyàn)目的：第二页，共十四页。细胞死活鉴定的方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法简便，易于操作。但是通过直接的形态来鉴定细胞死活，实验结果很容易受主观因素的影响，存在一定的误差，因此，在实际操作中也常用一些仪器来进行精确的批量检测(jiǎncè)。不同的鉴定方法有不同具体的反应机理，但都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。染色法分化学染色法和荧光染色法。根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死细胞着色法（台盼蓝、氨基黑、赤藓红B）、活细胞着色法（结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝）。荧光染色（吖啶橙-活细胞细胞核呈黄绿色或亮绿色荧光死细胞细胞核呈红色荧光).二、实验(shíyàn)原理：第三页，共十四页。仪器分析法可采用微电极技术（利用死活(sǐhuó)细胞膜两侧电位的差异）、全自动分析细胞记数仪和流式细胞仪等，可对细胞的死活进行精确的批量检测。活细胞的细胞膜是一种选择性膜，而细胞死亡之后，细胞膜通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜，所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色，甲基蓝有类似的染色机理。正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色，通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。第四页，共十四页。1、材料贴壁细胞2、试剂0.4%的台盼蓝染液、0.25%的胰酶、含10%血清的1640培养液、PBS(磷酸缓冲盐溶液,一般作为溶剂，起溶解保护(bǎohù)试剂的作用,保护生物蛋白的结构及生物特性，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释)3、器材载玻片、盖玻片、倒置相差显微镜、试管、培养瓶（皿）、滴管、血球计数板三、实验(shíyàn)用品第五页，共十四页。1、试剂配制：用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液，备用。称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。2、细胞悬液制备(zhìbèi)：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，PBS清洗两遍，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液（消化细胞、...
