细胞核与线粒体的分级分离第一页，共二十页。第一页，共二十页。1.初步了解细胞内各种成分的分离方法2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法3、对分离得到(dédào)的细胞核及线粒体进行活性鉴定。一、实验(shíyàn)目的第二页，共二十页。第二页，共二十页。细胞器分离(fēnlí)基本步骤二、实验(shíyàn)原理细胞(xìbāo)破碎分离、纯化细胞器鉴定第三页，共二十页。第三页，共二十页。（一）细胞破碎(pòsuì)的方法1.杆状玻璃匀浆器法2.高速组织捣碎机法3.超声波处理法4.化学裂介法5.反复冻融法二、实验(shíyàn)原理第四页，共二十页。第四页，共二十页。细胞破碎的注意事项：1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液（0.25mol/L）。它比较近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂(pòliè)，对酶活性干扰小，在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。第五页，共二十页。第五页，共二十页。（二）分离纯化的方法根据细胞器的大小、形状(xíngzhuàn)、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。二、实验(shíyàn)原理第六页，共二十页。第六页，共二十页。差速离心法根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；须经反复悬浮和离心加以纯化。②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形(biànxíng)、聚集而失活。第七页，共二十页。第七页，共二十页。第八页，共二十页。第八页，共二十页。密度梯度离心(líxīn)下次(xiàcì)课讲第九页，共二十页。第九页，共二十页。（三）细胞器的鉴定分析分析分级分离得到的组分，可用细...
