25/1/26RNA第一页，共四十九页。25/1/26◆人类细胞质RNA提取◆RT-PCR的原理、方法◆琼脂糖凝胶电泳结果(jiēguǒ)分析及其应用主要(zhǔyào)内容第二页，共四十九页。人类(rénlèi)细胞质RNA提取第三页，共四十九页。25/1/26电泳(diànyǒnɡ)PCR提取(tíqǔ)总RNA合成(héchéng)cDNA第一链第四页，共四十九页。25/1/26真核细胞RNA的种类(zhǒnglèi)真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于(wèiyú)细胞质中。大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一多聚A(PolyA)尾巴。第五页，共四十九页。25/1/26实验(shíyàn)前的准备RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染(wūrǎn)。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。第六页，共四十九页。25/1/26常用(chányòn)ɡɡ的RNA酶抑制剂1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，进而使RNA酶失活，有高致癌性。（实验准备阶段使用）2、异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。3、RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘(tāipán)中提取得来的酸性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用）第七页，共四十九页。25/1/26实验(shíyàn)原理Trizol试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使(cùshǐ)核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。第八页，共四十九页。25/1/26提取(tíqǔ)RNA（一）、准备(zhǔnbèi)试剂•氯仿•异丙醇•75℅乙醇•无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用(xūyònɡ)DEPC处理过的水配制)第九页，共四十九页。25/1/26提取(tíqǔ)RNA（二）、操作步骤取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约2~3min，用15ml离心管（4000rpm5min）收集细胞(xìbāo)(同管多次离心)，弃上清第十页，共四十九页。25/1/26提取(tíqǔ)RNA（二）、操作步骤小心吸取上清，转移至新的1.5mlEp管，加入等体积的异丙醇，15~30℃放置10min第十一页，共四十九页。25/1/26提取(tíqǔ)RNA（三）、注意事项1、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压...
