腐烂茎线虫检疫鉴定方法 GBT 29577-2013.pdf

GB/T29577-2013的第3章所列的用具。6试剂6.1形态学鉴定用试剂参见SN/T1141一2002中的第4章所列试剂.6.2分子检测试剂WLB(500mmol/L氯化钾、10mmol/L Tris-盐酸、pH8.0、15mmol/L氯化镁、1.0mmol/LDTT,4.5%吐温20)、蛋白酶K(600mg/mL)、10PCR级冲液(-20保存)、25mmol/L氯化钙溶液（一20保存）、dNTP(10mmol/L)、Tag将(5U/L,一20保存)、6载样缓冲液、TAE或TBE电泳缓冲液、琼脂糖、溴酚蓝载样缓冲液(6TAE缓冲液，60%甘油，0.3%溴酚蓝，4保存)、溴化乙锭(EB,避光保存)，DNA ladder marker(一20保存)、DNA凝胶回收试剂盒（室温保存）、EcoR I酶(一20保存)、大肠杆菌DH5a感受态细胞（一70保存）、质粒提取试剂盒（室温保存）。7现场检测7.1检查对植物进行检查，注意植物地上部分是否有生长不良，叶色失绿、黄化，植株矮化等症状：块茎、鳞茎，球根等是否有干腐，变黑等症状。收集上述有为害症状的可疑植物材料及其夹带的介质或土壤，做好记录，写上标签，带回实验室检验，7.2抽样应有针对性地抽取具有可疑症状的样品，分别用塑料袋装好，加贴标识：带回实验室后，打开袋口透气，适当保温，放在2025室内待检。对于无可疑症状的样品则按要求随机抽样，具休抽样比例按照SN/T1157、SN/T1158和SN/T2122中的规定进行抽样。8实验室检验8.1线虫分离采用两种方法进行分离：浅盘分离法按照SN/T1141一2002中B.2中对对线虫分离的要求进行，改进型漏斗法参见附录B。8.2标本制作见SN/T1141一2002中的附录C。8.3显微观察、描述和测计在显微镜下，对线虫进行形态观察、描述和测计。8.4分子生物学检测对形态特征观察可疑的线虫进行双重PCR分子生物学检测则（见附录C)。