外源基因在大肠杆菌中的表达第一页，共八十七页。外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为平安的基因工程受体生第二页，共八十七页。外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素第三页，共八十七页。外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数转录翻译第四页，共八十七页。Ptac=3Ptrp=11Plac启动子第五页，共八十七页。转录调控机理具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子〔lacP〕-操纵基因〔lacO〕-结构基因〔lacZ-lacY-lacA〕正调节因子CAP负调节因子lacI启动子Lac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为根底设计、构建的表达系统第六页，共八十七页。lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录cAMPCAPlacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录Lac表达系统正调节因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进Plac介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAP第七页，共八十七页。Lac表达系统lacUV5突变体PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。第八页，共八十七页。Lac表达系统负调节因子lacI在无诱导物情形下，lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNA第九页，共八十七页。Tac表达系统tac启动子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子。第十页，共八十七页。lac、tac启动子对宿主菌的要求在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要。当多拷贝的lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻遏蛋白与lacO的比例显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的Lac...
