大豆低聚糖优异种质鉴定及GWAS分析_李岩哲.pdf

DOI：10.13430/ki.jpgr.20221028001植物遗传资源学报 2023，24（3）：780-789Journal of Plant Genetic Resources大豆低聚糖优异种质鉴定及GWAS分析李岩哲1，熊雅文1，许亚男1，唐威1，张红梅2，张威2，刘晓庆2，王琼2，许文静3，张群1，陈华涛1，2（1南京农业大学生命科学学院，南京 210095；2江苏省农业科学院经济作物研究所，南京 210014；3南京农业大学园艺学院，南京 210095）摘要：大豆中含有丰富的营养物质和活性物质，其中低聚糖有许多对人体健康有益的功能，大范围的鉴定评价并筛选大豆低聚糖特异种质具有重要的育种意义。本研究利用高效液相色谱法（HPLC，high performance liquid chromatography），测量了包含264份大豆材料的自然群体的蔗糖含量、棉子糖含量、水苏糖含量以及总低聚糖含量。结果表明3种低聚糖中蔗糖占总低聚糖的比例最高，棉子糖占比最低，海南三亚和江苏南京两个环境下大豆的总低聚糖含量范围分别为6.18%11.46%和4.19%13.80%，共筛选出不同环境下表现稳定的10份大豆低聚糖特异种质。结合大豆自然群体的低聚糖含量表型数据和基因型数据进行了全基因组关联分析，在不同环境下分别鉴定到与低聚糖显著关联的SNPs，并挖掘目的性状候选基因。本研究为特用大豆品种选育提供了材料支撑，为发掘大豆低聚糖候选基因和开发分子标记提供了较好的基础。关键词：HPLC；大豆低聚糖；GWAS；SNPIdentification and GWAS Analysis of Soybean Oligosaccharide GermplasmLI Yan-zhe1，XIONG Ya-wen1，XU Ya-nan1，TANG Wei1，ZHANG Hong-mei2，ZHANG Wei2，LIU Xiao-qing2，WANG Qiong2，XU Wen-jing3，ZHANG Qun1，CHEN Hua-tao1，2（1College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095；2Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014；3College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095）Abstract：Soybean is rich in nutrients and active substances.Oligosaccharides are beneficial functional components for human health，and identification of soybean oligosaccharide specific germplasms is of great practical significance.In this study，the content of oligosaccharides，including sucrose，raffinose，stachyose and total oligosaccharide，were quantified by high performance liquid chromatography（HPLC）method in a population of 264 soybean genotypes that were cultivated at two environments.It was shown that among the three oligosaccharides，sucrose accounts for the highest proportion of total oligosaccharides，and raffinose accounts for the lowest proportion.The total oligosaccharide content in Sanya city of Hainan province and Nanjing city of Jiangsu province ranged from 6.18%-11.46%and 4.19%-13.80%，respectively.Ten oligosaccharide specific genotypes with stable performance at different environments were obtained.Genome-wide association study（GWAS）was carried out by combining phenotypic and genotypic data of oligosaccharide content in natural soybean population.SNPs significantly associated with oligosaccharides content were identified and candidate genes were considered to be related with oligosaccharide/sucrose.Collectively，this study provided germplasm 收稿日期：2022-10-28 修回日期：2023-01-29 网络出版日期：2023-02-06URL：https：/doi.org/10.13430/ki.jpgr.20221028001第一作者研究方向为功能性大豆分子育种技术，E-mail：通信作者：陈华涛，研究方向为大豆分子育种技术及种质创新研究，E-mail：基金项目：江苏省重点研发计划（现代农业）重点项目（BE2019376）；国家重点研发计划项目（2018YFE0112200）；江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（20）2007）Foundation projects：Jiangsu Province Key Research and Development Program（Modern Agriculture）Key Project（BE2019376）；National Key Research and Development Program（2018YFE0112200）；Agricultural Science and Technology Independent Innovation Fund of Jiangsu Province（CX（20）2007）3 期李岩哲等：大豆低聚糖优异种质鉴定及GWAS分析resources applicable for the selection and breeding of special soybean varieties，and also provided foundation for further exploring oligosaccharide candidate genes and developing their molecular markers in soybean.Key words：HPLC；soybean oligosaccharide；genome-wide association study；SNP大豆（Glycine max（L.）Merr.）在中国具有悠久的栽培历史，是中国重要的经济和油料作物之一。大豆中不仅含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等营养物质，还含有低聚糖、皂苷、磷脂、异黄酮等生物活性成分1。大豆低聚糖（SBOS，soybean oligosaccharides）是大豆中可溶性糖的总称，主要包括蔗糖（二糖）、棉子糖（三糖）和水苏糖（四糖）等2。大豆低聚糖在大豆中占比约为7%10%，其中蔗糖含量最高约占5%，水苏糖约4%，棉子糖含量最少，约为1%。通常以大豆、大豆粕、大豆胚芽为原料生产大豆低聚糖3。低聚糖具有多种生物活性，其中水苏糖和棉子糖具有甜度低、热值低等良好的理化特性，同时能促进双歧杆菌的增殖，促进菌群繁殖，平衡肠内菌群，可防止便秘和腹泻4-5。低聚糖具有保护肝脏、降低血压、血脂、抗癌、延缓衰老、抑制病原菌的增长、增强免疫力等作用6。1988年日本大豆低聚糖产品正式上市，主要有糖浆、粉末、颗粒剂等产品。我国对低聚糖研究起步较晚但发展较快，自1996年保龄宝生物股份有限公司大量生产功能性低聚异麦芽糖产品以来，中国功能性低聚糖市场取得了迅猛的发展7。目前在含乳饮料中使用得比较广泛和成熟，少量用于糖果和酒类等生产，还有一部分作为保健品或保健品的配料使用8。大豆低聚糖组成与含量在大豆种质资源中存在着显著差异，高蔗糖低水苏糖大豆适合进行豆腐加工9，低蔗糖高水苏糖大豆适于进行大豆低聚糖加工10-11。此外，研究还发现低聚糖在植物生长发育、逆境胁迫反应等过程中发挥着重要作用，低聚糖在成熟种子中积累，与种子活力和耐旱性密切相关，通过调控棉子糖合成酶提高植物抗旱能力4。鉴于大豆低聚糖的重要应用价值，大范围的鉴定、评价并筛选高低聚糖大豆优异种质受到研究者的广泛重视。基于连锁不平衡（LD，linkage disequilibrium）的全基因组关联分析（GWAS，genome-wide association study）已广泛应用于各种作物不同性状的基因挖掘研究中。GWAS利用自然群体中广泛的遗传多样性和全基因组高密度的单核苷酸多态性标记（SNP，single nucleotide polymorphism）筛选与表型变异显著相关联的SNP标记。GWAS高通量发掘目标性状显著关联位点的优势已经成为研究基因组学的关键手段之一12。GWAS 具有耗时短、成本低和遗传信息来源广泛等优点。全基因组关联分析在大豆的不同性状中广泛应用，如油脂、蛋白质和百粒重等通过 GWAS 分析获得大量显著关联位点13-15。本研究利用HPLC测定大豆籽粒中低聚糖组分含量，结合GWAS鉴定与大豆低聚糖显著关联的SNP位点，为大豆分子育种开发标记和发掘低聚糖关键候选基因打下基础。1材料与方法1.1试验材料264份大豆种质资源，包含52份地方种和212份栽培种，由江苏省农业科学院经济作物研究所大豆课题组提供16。2020年种植于海南三亚试验基地（109.685092E，18.334734N）；2021年种植于江苏南京六合试验基地（118.634071E，32.47821N）。田间材料播种采取随机区组设计，3次重复。单次重复种植3垄，每垄播种10穴，每穴两株苗，垄长1.5 m，垄间距40 cm，穴距15 cm。按照常规田间管理方法，收获后及时晒干、脱粒保存。1.2色谱条件色谱柱：日本岛津shim-pack GIST-NH2（4.6 mm250 mm，5 m）；流动相：乙腈/水=63/37（V/V）（超声脱气30 min）；流速：1 mL/min；色谱柱温度30；检测器温度35；进样体积10 L；检测器：（RID）示差折光检测器。1.3标准溶液的配制及标准曲线绘制准确称取蔗糖50 mg，棉子糖、水苏糖各25 mg（精确至0.1 mg），置于25 mL容量瓶中用80%乙醇溶液溶解并定容，配制成蔗糖、棉子糖、水苏糖标准液，浓度分别为2 mg/mL、1 mg/mL、1 mg/mL，放置于4 冰箱中保存备用。移取适量标准液，用80%乙醇进行梯度稀释，其中蔗糖浓度分别稀释为2 g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL、0.25 g/mL 4个浓度梯度的标准工作液。棉子糖和水苏糖浓度均分别稀释为1 g/mL、0.5 g/mL、0.25 g/mL