肾病综合征模型大鼠的阿霉素构建方法比较_戴淑娟.pdf

87安徽医专学报 2022 年 21 卷第 6 期肾病综合征模型大鼠的阿霉素构建方法比较戴淑娟1 方 庆2【中图分类号】R692【文献标识码】【文章编号】2097-0196（2022）06-0087-03【摘 要】目的：考察不同的阿霉素给药方案建立合适的肾病综合征大鼠模型情况。方法：选取健康SPF级大鼠40只，随机分为4组，每组10只。正常对照组大鼠给予1 mL生理盐水；模型组大鼠采用尾静脉注射阿霉素溶液法，总剂量分别为6 mg/kg（单次注射）、7.5 mg/kg（隔周两次注射）、6 mg/kg（隔周两次注射）。观察大鼠一般状态、尿蛋白、生化指标、肾功能病理指标变化。结果：单次6 mg/kg组大鼠死亡3只，隔周两次7.5 mg/kg组死亡2只、隔周两次6 mg/kg组死亡1只。三组模型组大鼠造模2、4、8周后的24 h尿蛋白水平均高于正常对照组，差异具有统计学意义（P0.01）。隔周两次7.5 mg/kg组在造模8周时的大鼠血清TG、TC、Scr和BUN的水平均显著高于对照组，差异有显著统计学意义（P0.01）。同时隔周两次7.5 mg/kg组肾组织病变程度较其他组严重。结论：在8周实验周期内，隔周两次注射7.5 mg/kg剂量组能够保持比较显著的肾病综合征特点，适合构建肾病综合征模型。【关键词】阿霉素肾病综合征大鼠模型肾病综合征（nephroticsyndrome，NS）是由多种病理原因所引起的肾小球疾病中的一组临床症候群1，其发病原因复杂，发病机制目前尚不清楚。开拓NS的治疗方案，提升NS治愈率以及降低疾病复发率，已成为当前此类研究关注的热点。NS临床症状的特征非常显著，其典型临床表现包括大量蛋白尿、高脂血症、水肿及低蛋白血症等，其中以大量蛋白尿为最基本特征1。因此，在肾病综合征动物模型构建的过程中，最关键的是该模型能够表现出疾病的典型临床症状。在实验动物研究中，作为模拟主要肾病临床症状的动物模型方法，阿霉素注射法构建的肾病综合征2-3，已得到广泛认可。以往研究4提示：阿霉素给药剂量与给药频率的差异，可导致病理状态的改变。在造模周期的不同时间段，一些关键的检测指标可呈现差异。从关键实验指标在不同造模周期内的变化入手，探讨相关机制，对深入探索药物对疾病的干预进程具有重要意义。本课题主要研究较长周期下肾病综合征大鼠尿水通道蛋白2（AQP2）与一氧化氮（NO）的相关性，据此设计差异化的阿霉素给药方法，探讨诱导大鼠肾病综合征模型的制备。根据以往相关文献的造模方法及经验，本课题选用尾静脉注射阿霉素溶液法，总剂量分别为6mg/kg（单次注射）、7.5mg/kg（连续两次隔周注射）、6mg/kg（连续两次隔周注射），探索构建合适的肾病综合征大鼠模型的方案。1 对象与方法1.1实验动物SD雄性大鼠，健康SPF级，体质量（20030）g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：2014（皖）-002。本动物实验研究遵循了国家制定的有关实验动物保护和使用的指南，并经过本单位实验动物伦理委员会批准。1.2主 要 仪 器 与 试 剂盐 酸 阿 霉 素（批 号：18003012）；BCA试剂盒；氯化钠注射液（批号：1701062332）。全自动生化分析仪，日本岛津公司；德国LeicaRM2135切片机；光学显微镜，日本Olympus；DP70数码拍照装置，日本Olympus；酶标仪，美国ThermoLabsystems公司，MultiskanMK2。1.3实验分组与处理40只雄性SD大鼠，体质量200230g，适应性喂养1周。将40只大鼠按体质量随机分为4组，每组10只。正常对照组大鼠给予1mL生理盐水。观察组单次剂量6mg/kg组，一次性尾静脉注射6mg/kg阿霉素溶液；两次6mg/kg组，第一次和第二次分别注射4mg/kg和2mg/kg，累计6mg/kg，隔周连续两次尾静脉注射；两次7.5mg/kg组，第一次和第二次分别注射4mg/kg和3.5mg/kg，累计7.5mg/kg，隔周连续两次尾静脉注射；诱导肾病综合征模型。1.4观察指标及检测方法分别于造模后2、4、8周收取大鼠24h尿液，检测24h尿蛋白。检测血液生化指标甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、肌酐（Scr）、血清尿素氮（BUN）、白蛋白（ALB）和血清白蛋白（TP）等。8周末处死大鼠，取肾脏标本行病理检测。肾组织置于4%中性甲醛溶液中24h后，流水冲洗过夜，经乙醇梯度脱水、二甲苯 作者单位：1.安徽医学高等专科学校安徽合肥2306012.安徽中医药大学药学院安徽合肥230051基金项目：安徽省2018年高校自然科学研究项目（编号：12925KJ2018B01）2022-09-23收稿，2022-10-26修回医学基础与药学研究医学基础与药学研究88透明、石蜡包埋、切成4 的切片，按照HE染色试剂说明书操作，行染色观察大鼠肾组织病理学改变。1.5统计学分析实验涉及数据以SPSS22统计学软件处理，结果以均数标准差表示，采用t检验；多组数据结果以单因素方差进行分析，方差齐性则以LSD法作组间分析。P0.05为差异具有统计学意义。2 结 果2.1四组大鼠形态体征的观察比较采用尿蛋白试纸定性监测大鼠尿蛋白。试验期间，空白对照组大鼠食欲旺盛，反应灵敏，体质量持续增加，尿蛋白含量没有上升；所有模型组大鼠从第3天起陆续开始出现蛋白尿，之后尿蛋白含量每日逐渐上升。造模4天后，模型组大鼠开始出现腹泻，第10天最为明显。造模期间大鼠毛色蓬松无光泽、精神萎靡、进食量下降、活动显著减少、体质量明显减轻、出现眼鼻部血性分泌物、尾巴溃烂等表现。实验结束后，阿霉素注射单次6mg/kg组有3只大鼠死亡；隔周两次6mg/kg组中1只大鼠死亡，而隔周两次7.5mg/kg组有2只大鼠死亡。死亡原因可能与严重腹泻或较强的阿霉素毒性有关。2.2四组大鼠尿蛋白的测定比较阿霉素注射2周后，三组模型组大鼠24h尿蛋白较正常对照组均明显升高（P0.01），表明造模成功。所有模型组大鼠于造模4周时所测的尿蛋白含量均明显高于造模2周时，差异具有统计学意义（P0.05或P0.01）。在 造 模8周 后，尾 静 脉 单 次 注 射6mg/kg组尿蛋白含量开始逐渐下降；隔周两次6mg/kg组和两次7.5mg/kg组仍呈提升趋势，但将两组第8周与第4周的尿蛋白相比较，差异无统计学意义（P0.05）。见表1。表1 不同造模方法对各组大鼠24h蛋白尿定量的比较（xs，mg）组别n造模2周造模4周造模8周正常对照组10 69.3018.9576.0313.9571.2415.82单次6 mg/kg组7 236.7546.70*325.2486.45*265.1741.42*两次6 mg/kg组9 220.5846.74*288.2947.45*304.7382.16*两次7.5 mg/kg组8 239.7161.77*382.3683.19*470.4682.22*注：与正常对照组比较：*P0.05，*P0.01；与造模2周比较：P0.05，P0.012.3四组大鼠生化指标的测定比较与正常对照组大鼠相比，不同阿霉素给药方案中模型组大鼠ALB和TP的表达量下降，含量显著降低，差异具有统计学意义（P0.01）。单次6mg/kg组和两次6mg/kg组在造模8周时的大鼠血清TC亦高于正常对照组，差异具有统计学意义（P0.05）。而隔周两次7.5mg/kg组在造模8周时的大鼠血清TG、TC、Scr和BUN的表达量均明显增加，水平均显著高于正常对照组，差异有显著统计学意义（P0.01）。相较于其他模型组大鼠，隔周两次7.5mg/kg组各项血液生化指标在造模8周后具有明显的肾病综合征特征，且模型稳定。见表2。表2 不同造模方法对大鼠生化指标含量的影响（xs）组别nTG(mmolL-1)TC(mmolL-1)BUN(mmolL-1)Scr(molL-1)TP(gL-1)ALB(gL-1)正常对照组100.880.122.010.316.080.9545.126.9351.624.6225.252.70单次 6 mg/kg 组71.120.10*2.720.55*8.131.35*64.7110.67*48.003.69*19.141.88*两次 6 mg/kg 组91.200.06*2.860.39*10.582.00*73.678.58*45.682.29*18.351.52*两次 7.5 mg/kg 组81.330.15*3.230.51*11.571.79*85.349.19*40.481.55*15.481.39*注：与正常对照组比较*P0.05，*P0.01图 A图 A图 B图 B图 C图 C图 D图 D注：A：正常对照组；B：单次6 mg/kg组；C：两次6 mg/kg组；D：两次7.5 mg/kg图1 不同模型方法各组大鼠肾组织HE染色（*400）2.4四组大鼠肾组织病理改变的比较光镜下观察结果提示，正常对照组肾小球、肾小管结构正常，形态学无明显异常；不同造模方法模型组（观察组）大鼠均见肾小球增大、系膜基质增多、毛细血管堵塞；肾小管扩张、有上皮细胞颗粒变性，蛋白管型多见，间质可见炎性细胞浸润。在所有各模型组中，以隔周两次7.5mg/kg阿霉素注射组大鼠肾脏组织病变程度最为严重。见图1。3 讨 论阿霉素诱导肾病综合征大鼠模型的机制主要为直接损伤肾小球上皮细胞，诱发细胞外基质蛋白等结构和功能紊乱。此外，阿霉素还促使肾小球固有细胞产生和释放自由基，进一步损伤肾小球结构。采用阿霉素注射法建立肾病综合征大鼠模型，一般造模5天左右开始出现尿蛋白，1014天出现大量尿蛋白，4周时表现为典型的肾病综合征症状。此方法操作简单，周期较短，症状较为明89安徽医专学报 2022 年 21 卷第 6 期显，故阿霉素诱导动物模型是目前公认的肾病综合征动物制备模型。现阶段，以尾静脉注射阿霉素诱导肾病综合征的大鼠模型制备方法较多、给药方法和剂量5-9也不尽相同。本实验旨在寻找符合课题要求、造模成功率高且大鼠死亡率低的造模方法。实验结果表明，阿霉素用药方法不同及剂量不同对大鼠血生化含量和肾组织病理的影响有较明显差异。通过对血生化指标观察后发现，单次阿霉素注射组（剂量6mg/kg）较其他模型组对各项生化指标影响较小；且大鼠24h尿蛋白在造模4周时升高明显，但8周时呈现下降趋势。而两次隔周注射6mg/kg模型组与7.5mg/kg模型组大鼠尿蛋白含量在造模8周后持续明显升高，生化含量变化明显，且大鼠死亡率下降，可能是由于较低剂量的阿霉素剂量多次注射所致。两次隔周注射7.5mg/kg模型组在8周实验周期内肾组织病变程度最为严重，可维持较典型的肾病综合征特征，可能与总给药剂量较大、且两次给药造成大鼠肾脏持续性损伤有关。综 上 所 述，两 次 隔 周 尾 静 脉 注 射 阿 霉 素7.5mg/kg法可作为诱导制备肾病综合征大鼠模型的方法，并将应用于本课题后续研究中。参考文献1 戴淑娟,王运来.当归芍药散对肾病综合征大鼠的药效学研究J.通化师范学院学报,2017,38(4):14-18.2 魏伟,吴希美.药理实验方法学M.第4版,北京:人民卫生出版社,2010.3 Pereira Wde F,Brito-Melo G E,de Almeida C A,et al.The experimental model of nephrotic syndrome induced by Doxorubicin in rodents:an updateJ.Inflamm Res,2015,64(5):287-301.4 蔺建军,杨勇,高娜,等.阿霉素注射次数及剂量对肾病综合征模型的影响J.中国中西医结合肾病杂志,2011,12(8):676-678.5 李爱平,张王宁,秦雪梅.阿霉素肾病大鼠模型的优化J.中草药,2018,49(1):151-159.6 周桥,卢颖,仲芳.蛋白酶体抑制剂硼替佐米对阿霉素肾病大鼠肾脏的保护作用J.上海交通大学学报(医学版),2011,31(2):158-16