木瓜蛋白酶提取辣木籽多肽的工艺研究_梁敏丽.pdf

2023 年 第 4 期 广 东 化 工 第 50 卷 总第 486 期 67 木瓜蛋白酶提取辣木籽多肽的工艺研究木瓜蛋白酶提取辣木籽多肽的工艺研究 梁敏丽，莫柳艳，劳燕芹，余泳佳，郑韵英*(北部湾大学 石油与化工学院，广西 钦州 535011)摘 要以脱脂辣木籽粉为原料，选用超声波辅助木瓜蛋白酶提取其多肽，考察酶在不同 pH、加酶量、超声功率、超声时间以及温度对脱脂辣木籽多肽含量的影响。在单因素的基础上，再通过设计 L9(34)正交试验，得到超声波辅助木瓜蛋白酶提取多肽的最佳工艺为：超声温度为 50、酶添加量为 3.5%、pH 为 7、超声功率为 210 W、超声时间为 45 min，在该条件下，得到取辣木籽多肽浓度达到 5.13 mg/mL。本研究为辣木籽多肽提取及其活性成分的继续深入研究提供参考价值。关键词辣木籽；多肽；木瓜蛋白酶；提取 中图分类号TS202.1 文献标识码A 文章编号1007-1865(2023)04-0067-04 Study on Extraction of Moringa Oleifera Polypeptide by Papain Liang Minli,Mo Liuyan,Lao Yanqin,Yu Yongjia,Zheng Yunying*(College of Petroleum and Chemical Engineering,Beibu Gulf University,Qinzhou 535011,China)Abstract:The study used defatted moringa oleifera seed powder as raw material,Papain was used to extract peptides by ultrasonic assisted enzymatic hydrolysis,The effects of different pH,enzyme amount,ultrasonic power,time and temperature on the content of Moringa oleifera polypeptide were investigated.By designing L9(34)orthogonal test,The best extraction process were as follows:ultrasonic temperature 50,enzyme dosage 3.5%,pH 7,ultrasonic power 210 W,ultrasonic time 45min.Under this condition,the concentration of polypeptide from Moringa oleifera seeds reached 5.13 mg/mL.This study provides a reference for the further study of Moringa oleifera polypeptide extraction and its active components.Keywords:Moringa seed；Polypeptide；Papain；extract 辣木籽，呈球状，直径大概8 mm，有三棱褐色的外壳，在种子的基部有膜质的翅1。在我国主要种植在海南南部、台湾、福建、广西等地区2,3，中国为了进一步推动辣木在中国的发展，2016年1月8日，成立了中国辣木产业联盟4，辣木籽营养丰富，其蛋白质、维生素、多糖、矿物元素(P、K、Mg、Na、Ca、Fe、Cu、Zn、Se)等营养物质含量较高5-，成为近年来的研究热点，主要在其营养功能7、营养成分、药理研究8、油脂提取9、蛋白质提取10、多糖提取15等方面有普遍的研究，有研究表明辣木含有抗菌12、抗癌13、护肝14、降三高15-16等功效的药用成分。其中多肽具有抗氧化性、降血压等生理功能和易吸收、无毒副作用等优点，广泛应用于医药、化妆品、食品等行业17。多肽一般以微量的含量存于生物体内，具有能够和蛋白质相似的生物活性，具有良好的易消化吸收作用、降血压、降血脂、降胆固醇、抗菌、抗氧化、抗炎、调节免疫、促进矿物质吸收等作用18-19，目前国内外对于生物多肽的提取方法主要有：酶解法20，碱溶酸沉法21，超声波提取法22，微生物发酵法23等等，如张静等24则是用碱性蛋白酶直接水解制备得到花芸豆多肽。周丽卿25采用碱溶酸沉法提取鹰嘴豆多肽获得了较好的提取效果，聂艳峰等26在直接酶解的基础上加入了超声辅助功能来提取多肽以达到优化目的，牟金秀27采用微生物发酵法对玉米多肽进行提取制备，制备效果显著提高，获得较高的转化率。目前对辣木籽的研究主要集中在蛋白质提取、油脂提取、营养功能、脂肪酸组成、多糖和多酚等研究方面，对辣木籽多肽的报道较少。本研究选用脱脂后的辣木籽粉为原料，采用超声波辅助木瓜蛋白酶酶解法提取辣木籽多肽，为辣木籽功能化产品生产提供参考价值。1 材料与方法材料与方法 1.1 材料与仪器 脱 脂辣 木籽 粉 由 广西 习 缘 辣木有限公司提供，Gly-Gly-Tyr-Arg 标准品 上海麦克林生化科技有限公司；碱性蛋白酶 北京谱析标准技术有限公司；其余试剂均为优级纯试剂。HR/T16M 台式高速冷冻离心机 湖南郝西仪器装备有限公司；KQ-300DE 数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；UV-2600 紫外可见分光光度计 岛津公司。1.2 实验方法 1.2.1 标准曲线的测定 参考张静等23人关于多肽标准曲线试验的方法，稍做修改后制定多肽的标准曲线。由于三氯乙酸易潮解的性质，所以提前配制好质量分数 100%的三氯乙酸溶液备用，取一定量由100%三氯乙酸溶液稀释成质量分数为 5%的 TCA 溶液用来依次配制 0.0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mg/mL的 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准溶液；然后从 10 mL 容量瓶中分别取 6 mL 四肽标准溶液置于 10 mL 离心管，同时加入 4 mL双缩脲试剂，借助漩涡混合器使其混合均匀，静置 0.5 h 后于3000 r/min 条件下离心 5 min。在紫外分光光度计的测量下知道四肽标准溶液的波长为 540 nm，取上清液于波长 540 nm 下测定吸光值，以肽的浓度为横坐标 X(mg/mL)，吸光值为纵坐标 Y，制作标准曲线。1.2.2 工艺流程 脱脂辣木籽粉酶解提取灭酶辣木籽多肽酶解液去蛋白多肽含量测定。1.2.3 辣木籽蛋白沉淀工艺 取经过处理的一定体积酶解液，加入提前稀释好的质量分数为 10%的 TCA 水溶液同样的体积，使用旋涡混合器仪器使得这两种溶液得到充分震荡均匀，接着孵育 10 min，然后在高速离心机 4500 r/min 条件下离心 10 min，得到上清液。1.2.4 多肽含量的测定 将经过离心沉淀得到的上清液转至50 mL比色管中，然后用质量分数为5%的三氯乙酸水溶液定容到刻度线，摇晃使其混合。用10 mL规格的移液枪从上述50 mL溶液中移取6 mL置于10 mL离心管中(空白用5%TCA代替)；用5 mL规格的移液枪移取4.0 mL双缩脲试剂加入，然后混合均匀后孵育30 min。在高速离心机3000 r/min条件下离心5 min，取上清液于540 nm下测定吸光值，对照 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线求得所测样品溶液中的多肽浓度 c(mg/mL)，进而可求得样品中多肽含收稿日期 2022-07-31 基金项目 广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(2021KY0439)；北部湾大学大学生创新创业训练计划资助项目(S202111607109)；北部 湾大学大学生创新创业训练计划资助项目(S202111607113)作者简介 梁敏丽(1999-)，女，广西贵港人，大学本科学生，主要研究方向为精细化工。*为通讯作者：郑韵英(1983-)，女，广西北海人，高级实验师，主要研究方向为天然产物提取及其功能化利用。广 东 化 工 2023 年 第 4 期 68 第 50 卷 总第 486 期 量。Y=cn 其中，y 表示样品溶液中多肽质量浓度，单位为 mg/mL；c 表示标准曲线中得到的多肽质量浓度，单位为 mg/mL；n 表示稀释倍数。1.3 木瓜蛋白酶超声辅助酶解脱脂辣木籽粉单因素研究 1.3.1 不同温度的影响 在酶添加量(E/S)为2%，超声功率为240 W，pH为7，时间为1 h的条件下，改变木瓜蛋白酶酶解的温度，分别为35、40、45、50、55。比较不同温度对多肽含量的影响，确定最优的酶解温度。1.3.2 不同功率的影响 在酶添加量(E/S)为2%，酶解温度为50，pH为7，时间为1 h的情况下，修改超声功率的参数，即150 W、180 W、210 W、240 W、270 W。比较不同功率对多肽含量的影响，确定最优的超声功率。1.3.3 不同酶添加量的影响 在pH为7，时间为60 min，酶解温度为50，超声功率为210 W的条件下，改变酶添加量(E/S)，分别为0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%。比较不同酶添加量对多肽含量的影响，确定最优的酶添加量。1.3.4 不同时间的影响 固定酶添加量(E/S)为3%，超声功率为210 W，pH为7，酶解温度为50的条件下，探究15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min这几个时间变量对多肽含量的影响，确定最优的超声时间。1.3.5 不同pH的影响 在酶添加量(E/S)为 3%，时间为 45 min，温度设定 50，超声功率为 210 W 的条件下，改变 pH，分别为 3、4、5、6、7、8。比较不同 pH 对多肽含量的影响，确定最优的超声时间。1.4 正交试验 根据单因素实验，选出超声辅助酶解脱脂辣木籽粉效果影响较大的四个因素：超声温度(A)、酶添加量(B)、时间(C)、pH(D)为自变量，以多肽含量作为评价指标来确定影响的水平，设计L9(34)正交表进行优化试验。表表 1 正交试验设计正交试验设计 Tab.1 Orthogonal experimental design 水平 超声温度/酶添加量/%pH 1 40 2.5 6 2 45 3.0 7 3 50 3.5 8 1.5 数据处理 用Origin 2021软件处理数据绘图，正交试验用正交设计助手3.1软件。2 结果与讨论结果与讨论 2.1 标准曲线的绘制 图图 1 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线四肽标准曲线 Fig.1 Gly-Gly-Tyr-Ar tetrapeptide standard curve 根据实验结果以Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准品绘制出标准曲线图，见图1。从而得到回归方程y=0.1349x-0.00021，R2=0.9970。2.2 木瓜蛋白酶超声辅助酶解脱脂辣木籽粉最优条件筛选 2.2.1 不同超声温度对多肽含量的影响 图图 2 超声温度对多肽含量的影响超声温度对多肽含量的影响 Fig.2 The effect of ultrasonic temperature on polypeptide content 如图2所知，随着温度的升高，多肽含量呈先迅速增加后趋于平缓且有下降趋势，在温度为50 处多肽含量达到最大。出现这种曲线变化是因为温度太低，不在酶的最适温度范围内，抑制了酶的活性；再往后的多肽含量有下降趋势，酶活性受到温度高的影响而钝化变性失活，所以选择50。2.2.2 不同超声功率对多肽含量的影响 图图 3 超声功率对多肽含量的影响超声功率对多肽含量的影响 Fig.3 The effect of ultrasonic power on polypeptide content 如图3所知，随着功率的升高，多肽含量呈先增加后下降的趋势，在功率为210 W