m-7G甲基化相关基因与H...R患者免疫特征的关联性研究_杨茜萍.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2022 Dec；39（12）m7G甲基化相关基因与HIV-INR患者免疫特征的关联性研究*杨茜萍，韦宜汝，黄颉刚（广西医科大学公共卫生学院广西艾滋病防治研究重点实验室，南宁530021）摘要目的：探讨N7-位鸟苷（m7G）甲基化相关基因在HIV-1无免疫应答患者（HIV-INR）体内的变化及其与免疫功能的相关性。方法：基于多个GEO数据集，利用R语言软件包识别出m7G甲基化相关差异基因（DMGs），利用广义线性模型（GLM）和支持向量机（SVM）以及列线图模型预测特征基因，与患者单样本基因集富集分析（ssGSEA）免疫细胞浸润进行相关性分析。共识聚类对差异基因等进行m7G聚类亚型分析，亚型之间的差异基因构建GO和KEGG富集通路等。结果：最佳模型SVM筛选出特征基因EIF3D和SNUPN，且与HIV-INR患者的免疫功能具有较强相关性。患者m7G聚类可以分为a、b两个亚型，亚型之间的m7G评分等存在显著差异，其上调、下调基因所富集的通路不同，与心肌缺血等严重非艾滋病事件相关。结论：m7G甲基化特征基因EIF3D、SNUPN的模型预测结果对HIV-INR患者的预后具有重要价值，可能是应对患者长期高效抗逆转录病毒治疗（HAART）下免疫反应障碍的新靶点。关键词HIV-1；m7G甲基化；诊断；共识聚类中图分类号：R512.91；R394.4文献标志码：A文章编号：1005-930X（2022）12-1903-08DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2022.12.006Study on the relationship between m7G methylation-related genes and immune features inHIV-INR patientsYang Xiping,Wei Yiru,Huang Jiegang.(School of Public Health,Guangxi Medical University,Guangxi KeyLaboratory ofAIDS Prevention and Control Research,Nanning 530021,China)AbstractObjective:To investigate the changes of the genes related to the methylation of guanosine on N7 posi-tion(m7G)in HIV-1 non-immune response patients(HIV-INR)and its correlation with immune function.Meth-ods:Based on the Gene Expression Omnibus(GEO)data sets,the m7G methylation-related differential genes(DMGs)were identified by R language software package,the feature genes were predicted by generalized linearmodel(GLM),support vector machine(SVM)and line graph model,and the correlation between them and im-mune cell infiltration was analyzed by single sample gene set enrichment analysis(ssGSEA).Consensus cluster-ing was used to analyze the clustering subtypes of DMGs,and the Gene Ontology(GO)and Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes(KEGG)enrichment pathways were constructed for different genes between subtypes.Re-sults:The best SVM model screened out the feature genesEIF3DandSNUPN,which had a strong correlationwith the immune function of HIV-INR patients.The m7G clustering of patients could be divided into two sub-types.There were significant differences in m7G scores among subtypes.The pathways enriched by the up-anddown-regulated genes were different,which related to serious non-AIDS events such as cardiac ischemia.Con-clusion:The prediction results of the m7G methylation geneEIF3DandSNUPNmodel are of great value for theprognosis of HIV-INR patients,and may be a new target to deal with the immune response disorder of patients un-der long-term highly active antiretroviral therapy(HAART).KeywordsHIV-1;m7G methylation;diagnosis;consensus clustering*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.82060366）；广西自然科学基金资助项目（No.2018GXNSFAA050099）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-11-30获得性免疫缺陷综合征（AIDS）又称艾滋病，自发现之日起至今已有40余年1。艾滋病患者虽然得到及时的高效抗逆转录病毒治疗（HAART），寿命得 1903广西医科大学学报2022 Dec；39（12）以延长，但病毒学抑制24个月后约有40%的患者会出现CD4+T细胞计数350个细胞/L的现象，被称为无免疫应答患者（HIV-INR）等2-3，临床上表现出比HIV免疫重建患者（HIV-IR）更为严重的免疫功能障碍以及更高的病死率，而该免疫反应不足的机制目前尚未阐明4。研究显示，接受HAART的HIV-1患者仍然会表现出DNA甲基化现象5。越来越多的研究也报道了RNA甲基化修饰在疾病进展中起重要作用，尤其是m6A甲基化修饰在多种肿瘤中异常表达6，具有泛癌性。在传染性疾病中，如COVID-197、H1N1流感8、HIV-19-10等也发现了m6A甲基化修饰的重要调控作用。而N7-位鸟苷（m7G）甲基化是另一种高度保守的RNA修饰形式，其中关于m7G甲基化修饰的Writer甲基转移样酶1（METTL1）被证实肿瘤中过表达，并与预后相关11，但关于m7G甲基化修饰是否也会与HIV-INR患者的免疫功能相关目前尚未见报道。因此，有必要揭示其内部变化以及关联性。1材料与方法1.1数据集筛选根据关键词“Human Immunode-ficiency Virus”分别在GEO数据库和Array Express数据库进行检索，纳入标准：存在 HIV-IR 和 HIV-INR样本数据集；排除标准：（1）样本数小于20；（2）HIV-INR患者不符合：CD4+细胞计数350个/L；HIV-IR患者不符合：CD4+细胞计数500个/L；筛选 过 后 GEO 数 据 库 中 符 合 条 件 的 数 据 集 为GSE143742、GSE10679212，共 85 个样本（HIV-IR：29例，HIV-INR：56例）。而Array Express数据库仅发现1个相关数据集E-GEOD-77939，但与GEO数据库的数据集GSE77939一致，且由于该数据集不符合筛选标准将其排除，因此，本研究将针对上述两个符合条件的GEO数据集使用“sva”包进行合并与批次矫正，为后续纯生信分析做数据准备。1.2m7G甲基化相关基因的获取根据关键词“7-methylguanosine”在MSigDB（https:/www.gsea-msig-db.org/gsea/msigdb/index.jsp）数据库检索，获取m7G甲基化相关基因集，去除非相关基因后，剩余26个相关基因。还分别从先前报道的文献中确定22个相关基因13，共48个进行后续分析。使用“limma”包对数据集进行差异基因的识别“pheatmap”包用于绘制热图，使用“corrlot”包对m7G相关基因进行相关性分析。1.3单样本基因集富集分析（ssGSEA）TISIDB数 据 库（http:/cis.hku.hk/TISIDB/index.php）下 载28 个肿瘤免疫浸润淋巴细胞数据集（TILs），并用“GSVA”R包进行ssGSEA分析，“vegan”和“ggcor”包用于计算DMGs与肿瘤免疫浸润细胞数据集的相关性。1.4共识聚类分析及m7G评分的构建“Consen-susClusterPlus”包被用于DMGs的一致性分析，其聚类结果应用于PCA分析，构建m7G 评分。将m7G不同聚类亚型中符合|logFC|0.7、P0.05 的差异基因（DEGs）用于后续基因共识聚类、基因疾病网络构建。主成分分析（PCA）来衡量单个样本中m7G甲基化修饰水平，该方法通过等式：m7G score=(PC1i+PC2i)构建评分，并提取PC1和PC2以形成特征评分14。1.5机器学习模型比较及列线图模型预测GLM和SVM 比较筛选最佳的预测模型，使用“caret”包将HIV-INR样本随机分为训练集（70%）和测试集（30%），“DALEX”用于3个模型的解释性分析评估效能差异，根据混淆矩阵和统计变量评估模型优劣，并对DMGs进行特征性排序分析。利用“rms”和“rmda”包绘制列线图模型的可靠性评估曲线、反应不同临床决策净效益的决策曲线分析（DCA）以及临床影响曲线（CIC），以评估列线图模型的决策应用效果。1.6基因富集分析和疾病交互网络构建基于基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书分析（KEGG），可以发现多个DEGs中富集的生物学功能与通路。Network Analyst 3.0（https:/-workanalyst.ca/）用于基因疾病最小交互网络的可视化构建。1.7统计学方法使用R软件（版本4.1.3）进行可视化分析，由于两组数据总体分布未知，因此使用Wilcoxon秩和检验比较两组之间的差异，Mantel检验用于相关性分析，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1HIV-IR患者和HIV-INR患者全血样本中识别出 17 个 DMGs在两种不同状况的患者中存在17个差异表达的m7G甲基化相关基因，且多数在 1904HIV-INR 患者中呈现显著下调趋势，如 RNMT、EIF3D、EIF4E3、DCP2 等（P0.001）（图 1A）。另外，ssGSEA分析显示，HIV-INR患者的免疫细胞浸润水平均低于HIV-IR患者（图1B）。2.2机器学习模型比较预测特征基因及相关列线图模型SVM和GLM在测试集中的预测效果通过残差图（图2A）、残差反向累计分布图（图2B）、ROC曲线（图2C）以及混淆矩阵结果等进行评价，综合评估后考虑SVM预测模型的效能更好，准确度更高（表1）。并根据SVM结果将17个DMG的特征重