细胞因子及免疫细胞功能检测方法简介刘素侠山东大学医学院免疫学研究所2011-2-23内容细胞因子检测的常用方法免疫细胞功能的常用检测方法一、免疫学检测的基本原理•抗原与抗体反应的特异性是各种免疫学检测技术的基本原理二、细胞因子检测方法•细胞因子的临床意义•常规测定法•胞内细胞因子检测方法•细胞因子检测的主要临床应用（一）细胞因子的临床意义•细胞因子与疾病：正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体的严格调控，在病理状态下细胞因子会出现异常性表达，表现为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因子受体的水平增加等。•细胞因子与治疗：重组细胞因子做为生物应答调节剂。已批准生产：IFN-α、β、γ，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在进行临床试验的：IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-β等（二）常规检测方法•分子生物学测定法•生物活性检测法•免疫化学测定法1.分子生物学测定法•是测定细胞因子mRNA的表达水平，主要有两种方法：•分子杂交技术•多聚酶链反应技术（PCR）分子杂交技术•制备细胞因子的基因探针；•Northern杂交或细胞原位杂交；•优点：高度敏感和高度特异；•缺点：操作较繁琐测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。多聚酶链反应技术（PCR）•PCR（polymerasechainreaction)技术，是一种高效的基因体外扩增技术；•将细胞因子产生细胞的RNA提取出来，再经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行PCR扩增；•优点：灵敏度高操作简便•缺点：测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。PCR原理•PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。•由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：dsDNAssDNA②退火(复性)：模板DNA与引物的互补配对③延伸：DNA模板与引物按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新DNA链•新链又可成为下次循环的模板,可将待扩目的基因扩增放大几百万倍5’3’5’3’变性退火延伸第二循环dsDNAssDNA加入引物5’3’3’5’dNTP,Taq酶5’3’5’5’3’3’3’5’5’3’5’5’反转录PCR（ReversetranscriptionPCR，RT-PCR)RTPCRRT-PCR反应过程反转录PCR：mRNA---cDNA---PCR•抽提RNA•反转录合成cDNA•PCR扩增RT反应体系•模板：总RNA，mRNA•引物：随机引物，Oligo(dT)，基因特...
