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Chapter 7 食品卫生细菌的检测技术食品卫生细菌的检测技术 学习目标学习目标 掌握学习食品中菌落总数检测程序和方法。掌握学习食品中菌落总数检测程序和方法。掌握学习食品中大肠菌群检测程序和方法。掌握学习食品中大肠菌群检测程序和方法。掌握食品中菌落总数和大肠菌群检测结果掌握食品中菌落总数和大肠菌群检测结果的报告方式。的报告方式。主要内容主要内容 食品中菌落总数的测定食品中菌落总数的测定 S1 食品中大肠菌群的测定食品中大肠菌群的测定 S2 S1 S1 菌落总数的测定菌落总数的测定 一、菌落总数 是指食品检样经过处理，在一定条件下是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后培养后,所得所得1mL(g)1mL(g)或或1cm1cm2 2面积检样中所含面积检样中所含菌落的总数菌落的总数.以菌落形成单位（以菌落形成单位（colony colony forming unit CFUforming unit CFU）表示。）表示。二、菌落总数测定的意义 1 1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2 2、预测食品存用的期限长短。、预测食品存用的期限长短。3 3、了解细菌在食品中的繁殖动态。、了解细菌在食品中的繁殖动态。三、菌落总数测定的方法 平板倾注法平板倾注法 平板表面涂布法平板表面涂布法 平板表面点滴法平板表面点滴法 四、平板倾注法测定菌落总数 检验步骤检验步骤(程序程序)：检样检样稀释处理稀释处理做平板做平板培养培养菌落计数菌落计数报告结果报告结果（一）、样品稀释及做平板 1ml 1ml 1ml 1ml 1:10 1:1000 1:100 1:10000 1ml 1ml 1ml 加入加入46营养琼脂营养琼脂1215ml 25g/ml样品 生理盐水 Note：检样从开始稀释到倾注最后一个平检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌，以防止细菌有所死亡或繁殖有所死亡或繁殖（二）培养 普通食品普通食品:37 48h :37 48h 倒放平板倒放平板 清凉饮料、调味品、糕点、酒类：清凉饮料、调味品、糕点、酒类：37 24h 37 24h 水产品水产品:30 48h:30 48h （三）计数和报告 到达规定培养时间，应立即计数。如果不能到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于立即计数，应将平板放置于0 044，但不得超过，但不得超过24h24h。（1 1）、单个菌做一个菌落计）、单个菌做一个菌落计 （2 2）、呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作）、呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。每条链均应按一个菌落计算。（3 3）、如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布）、如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘均匀，则可以半个平板的菌落数乘2 2代表全平板代表全平板的菌落数的菌落数。1.菌落的选择 2、平板菌落计数的选择、平板菌落计数的选择 （1 1）、选取菌落数在）、选取菌落数在30300之间的平板（之间的平板（SN标标准要求为准要求为25250个菌落）个菌落），若有二个稀释度均若有二个稀释度均在在30300之间时，比值小于或等于之间时，比值小于或等于2取平均数，取平均数，比值大于比值大于2则其较小数字。则其较小数字。（2 2）、如均大于）、如均大于300300，则取最高稀释度的平均菌落，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告数乘以稀释倍数报告 （3 3）、如均小于）、如均小于3030，则以最低稀释度的平均菌落，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告数乘稀释倍数报告 （4 4）、如菌落数有的大于）、如菌落数有的大于300300，有的又小于，有的又小于3030，不在不在3030300300之间，以最接近之间，以最接近300300或或3030的平均菌的平均菌落数乘以稀释倍数报告落数乘以稀释倍数报告 （5 5）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1 1乘以最低稀释倍数报告。乘以最低稀释倍数报告。3、菌落数的报告菌落数的报告 菌落数在菌落数在1100时，按实有数字报告，时，按实有数字报告，1)1)如大于如大于100时，则报告前面两位有效数字，时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。第三位数按四舍五入计算。2)2)固体检样以克（固体检样以克（g)为单位报告，为单位报告，3)3)液体检样以毫升（液体检样以毫升（ml）为单位报告，）为单位报告，4)4)表面涂擦则以平方厘米（表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。）报告。(四)、检验注意事项 1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；管口的外围部分；3、吸管插入试样液内的深度不得小于、吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm,调整调整时要使管尖与容器内壁紧贴时要使管尖与容器内壁紧贴;4、进行稀释时、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触吸管口不得与稀释液接触;5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过不宜超过20min.6、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。报告的依据。食品卫生细菌的检测技术 三、嗜热菌（芽孢）计数三、嗜热菌（芽孢）计数 （一）仪器用具（一）仪器用具 冰箱、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、托盘天平、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。（二）培养基和试剂（二）培养基和试剂 1葡萄糖-胰蛋白胨琼脂（同上）2亚硫酸盐琼脂 将胰蛋白胨10g、硫酸钠1g、硫乙醇酸钠5g溶解于1000mL蒸馏水中，加入5柠酸酸铁10mL，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，pH自然。分装烧瓶，121高压灭菌20min。3去氧肝汤 食品卫生细菌的检测技术 （三）操作步骤（三）操作步骤 将检样25g加入到盛有225mL无菌水的三角烧瓶内，迅速煮沸5min以杀死细菌繁殖体及耐热性低的芽孢，然后将烧瓶浸于冷水中冷却。1 1平酸菌计数平酸菌计数 在5只无菌培养皿中各注入2mL样液，用葡萄糖-胰蛋白琼脂做倾注平板，凝固后在5055培养4872h，计算5个平板上菌落的平均数。平酸菌在葡萄糖-胰蛋白琼脂平板上的菌落为圆形，直径25mm，具不透明的中心及黄色晕，晕很狭，产酸弱的细菌其菌落周围不存在，或不易观察到。平板从培养箱内取出后应立即进行计数，因为黄色会很快消退。如在培养48h后不易辨别是否产酸，则可培养到72h。食品卫生细菌的检测技术 2 2不产生硫化氢的嗜热性厌氧菌检验不产生硫化氢的嗜热性厌氧菌检验 将已处理过的样品加入等量新制备的去氧肝汤（总量为20mL）于试管中，以2无菌琼脂封顶，先加热到5055，然后在55中培养72h，当有气体生成（琼脂塞破裂，气味似干酪）时，可以认为有嗜热性厌氧菌存在。3 3产生硫化氢的嗜热性厌氧菌计数产生硫化氢的嗜热性厌氧菌计数 将已处理过的样品加入到已熔化的亚硫酸盐琼脂试管中（总量为20mL），共6份。将试管浸于冷水中，培养基固化后，加热到5055，然后在55培养48h。能产生硫化氢的细菌会在亚硫酸盐琼脂管内形成特征性的黑小片（因为硫化氢被转化为硫化铁等硫化物）。计算黑小片数目。某些嗜热菌不生成硫化氢，但代之以生成强大还原性氢，使全部培养基变黑色。食品卫生细菌的检测技术 四、厌氧菌计数四、厌氧菌计数 （一）仪器用具（一）仪器用具 冰箱、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、托盘天平、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。（二）培养基和试剂（二）培养基和试剂 硫乙醇酸盐琼脂的配制：将胰消化干酪素15g、L-胱氨酸0.5g、酵母浸膏5g、葡萄糖5g、氯化钠2.5g、硫乙醇酸钠0.5g、刃天青0.001g溶解于1000mL蒸馏水中，加入琼脂15g，加热煮沸，使琼脂溶化。调pH为7.07.1，分装烧瓶、试管中，121高压灭菌15min。食品卫生细菌的检测技术 （三）操作步骤（三）操作步骤 1 1倾注平板倾注平板 将检样稀释液lmL，注入于已溶化并晾至4550的硫乙醇酸钠琼脂管内，摇匀，倾注平板。2 2叠一层琼脂叠一层琼脂 冷凝后，在其上再叠一层3无菌琼脂。3 3培养、计数培养、计数 凝固后，在37培养96h，然后取出进行菌落计数。食品卫生细菌的检测技术 五、革兰氏阴性菌计数五、革兰氏阴性菌计数 （一）仪器用具（一）仪器用具 冰箱、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、托盘天平、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。（二）培养基和试剂（二）培养基和试剂 VRB琼脂的制备：将胰蛋白胨7g、酵母浸膏5g、氯化钠5g、乳糖10g、胆盐1.5 g溶解于1000mL蒸馏水中，加入琼脂15g，加热煮沸，使琼脂溶化，再加入中性红0.03g、结晶紫0.002g，再煮沸2min。pH7.40.2 （三）操作步骤三）操作步骤 1 1制备营养琼脂平板制备营养琼脂平板 倾注1520mL营养琼脂于无菌培养皿中，凝固后，在37烘去表面水分。食品卫生细菌的检测技术 2 2涂布涂布 吸注检样稀释液0.1mL于平板上，共2份，立即用无菌L形玻棒涂开，放置片刻。3 3层叠层叠VRBVRB琼脂琼脂 层叠已溶化并凉到4550的VRB琼脂34mL。4 4培养、计数培养、计数 在30培养48h后，计数菌落。食品卫生细菌的检测技术 S2 S2 大肠菌群的测定大肠菌群的测定 一、大肠菌群 1、什么是大肠菌群？指一群需氧及兼性厌氧，在37能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。2、大肠菌群的组成:大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。属 代表种 致病性 埃希氏菌属（Escherichia）大肠埃希氏菌(E.coli)肠道外感染，急性腹泻 志贺氏菌属（Shigella）痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)细菌性痢疾 爱德华氏菌属 （Edwardsiella）迟纯爱德华氏菌 (E.tarda)蛇类等血动物的正常肠道寄居菌，偶见于健康人或腹泻者粪便内 沙门氏菌属（Salmonella）伤寒沙门氏菌(S.typhi)肠热症、急性肠炎、败血症 枸橼酸杆菌属(Citrobacter)弗劳地氏枸橼酸杆菌(C.freundii)条件致病菌，引起继发性感染 克雷伯氏菌属(Klebsiella)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肺炎，泌尿系、创伤感染 败血症等 阴沟肠杆菌(Enterobacter)产气杆菌(E.aerogenes)很少引起原发性感染 哈夫尼亚菌属(Hafnia)蜂窝啥夫尼亚菌(H.alvei)对人无致病性 沙雷氏菌属(Serrati)粘质沙雷氏菌 (S.marcescens)条件致病菌，引起泌尿系，呼吸道及创伤感染 变形杆菌属(Proteus)普通变形杆菌(P.vulgaris)食物中毒，泌尿系、呼吸道感染 等 耶尔森氏菌属(Yersinia)鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)鼠疫 欧文氏菌属(Erwinia)草原居民欧文氏菌(E.herbicola)植物寄生菌，曾从人体肠道及化脓扁桃体中分离到 1 1、粪便污染的指标菌：、粪便污染的指标菌：大肠菌群或大肠杆菌大肠菌群或大肠杆菌 2 2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因、以大肠菌群作为粪便指标菌原因 1)在粪便中数量最大；在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3)检测方法简便容易。检测方法简便容易。二、大肠菌群的测定意义 3、大肠菌群的测定意义大肠菌群的测定意义（1）、判断食品中否受到粪便污染。（2）、有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）、有利于控制食品