副溶血性弧菌.doc

微生物实验是作业文件 文件编号：XMCDC/WS-SP05 副溶血性弧菌检验操作程序 第1页 共5页 第一版第0次修订 颁布日期：2010年05月12日 1范围 本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验方法。 本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。 2设备和材料设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 2.2冰箱：2 ℃～5 ℃、7 ℃～10 ℃。 2.3恒温水浴箱：36 ℃±1 ℃。 2.4均质器或无菌乳钵。 2.5天平：感量0.1 g。 2.6无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。 2.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 2.8无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL、1000 mL。 2.9无菌培养皿：直径90 mm。 2.10全自动微生物生化鉴定系统。 2.11无菌手术剪、镊子。 3培养基和试剂 3.13％氯化钠碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。 3.2硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：见附录A中A.2。 3.33％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录A中A.3。 3.43％氯化钠三糖铁琼脂：见附录A中A.4。 3.5嗜盐性试验培养基：见附录A中A.5。 3.63％氯化钠甘露醇试验培养基：见附录A中A.6。 3.73％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.7。 3.83％氯化钠MR-VP培养基：见附录A中A.8。 3.93％氯化钠溶液：见附录A中A.9。 3.10我妻氏血琼脂：见附录A中A.10。 3.11氧化酶试剂：见附录A中A.11。 3.12革兰氏染色液：见附录A中A.12。 3.13ONPG试剂：见附录A中A.13。 3.14Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录A中A.14。 3.15弧菌显色培养基。 3.16生化鉴定试剂盒。 4检验程序 副溶血性弧菌检验程序见图1。 微生物实验是作业文件 文件编号：XMCDC/WS-SP05 副溶血性弧菌检验操作程序 第2页 共5页 第一版第0次修订 颁布日期：2010年05月12日 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h 36 ℃±1 ℃，8 h～18 h 样品25 g（mL）+225 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水 3％氯化钠碱性蛋白胨水3管×3个合适的稀释度 如果进行定性检测，则不需要进行此步骤 挑取可疑菌落，接种于3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂 生化试验或选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统 结果与报告 血清学试验、神奈川试验 （可选作项） TCBS或弧菌显色培养基 筛选试验 氧化酶试验，革兰氏染色， 3％氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验 5操作步骤 5.1样品制备 5.1.1非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2℃～5℃不超过18 h解冻。 5.1.2鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。 5.1.3以无菌操作取样品25 g（mL），加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225 mL，用旋转刀片式均质器以8 000 r/min均质1 min，或拍击式均质器拍击2 min，制备成1:10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500 mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样 微生物实验是作业文件 文件编号：XMCDC/WS-SP05 副溶血性弧菌检验操作程序 第3页 共5页 第一版第0次修订 颁布日期：2010年05月12日 品1～2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1:10的样品匀液。 5.2增菌 5.2.1定性检测 将上述1:10样品匀液于36 ℃±1 ℃培养8 h～18 h。 2.2.2定量检测 5.2.2.1 用无菌吸管吸取1:10样品匀液1 mL，注入含有9 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的样品匀液。  5.2.2.2 另取1 mL无菌吸管，按5.2.2.1操作程序，依次制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用一支1 mL无菌吸管。 5.2.2.3 根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种三支含有9 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1 mL。置36 ℃±1 ℃恒温箱内，培养8 h～18 h。 5.3分离 5.3.1对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下1 cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 5.3.2典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm～3 mm。从培养箱取出TCBS平板后，应尽快（不超过1 h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。 5.4纯培养 挑取三个或以上可疑菌落，划线接种3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 5.5初步鉴定 5.5.1氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。 5.5.2涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。 5.5.3挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3％氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36 ℃±1 ℃培养24 h观察结果。副溶血性弧菌在3％氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。 5.5.4嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0％、6％、8％和10％不同氯化钠浓度的胰胨水，36 ℃±1 ℃培养24 h，观察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10％氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6％氯化钠和8％氯化钠的胰胨水中生长旺盛。 5.6确定鉴定 5.6.1生化试验：取纯培养物分别接种含3％氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h后观察结果；3％氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。 5.7报告 微生物实验是作业文件 文件编号：XMCDC/WS-SP05 副溶血性弧菌检验操作程序 第4页 共5页 第一版第0次修订 颁布日期：2010年05月12日 当检出的可疑菌落生化性状符合表1要求时，报告25 g（mL）样品中检出副溶血性弧菌。如果进行定量检测，根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每g（mL）副溶血性弧菌的MPN值。副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表2 表1 副溶血性弧菌的生化性状 试验项目 结果 革兰氏染色镜检 阴性，无芽胞 氧化酶 ＋ 动力 ＋ 蔗糖 － 葡萄糖 ＋ 甘露醇 ＋ 分解葡萄糖产气 － 乳糖 － 硫化氢 － 赖氨酸脱羧酶 ＋ V-P － ONPG － 注：＋阳性；－阴性。 表2 副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别 名称 氧化酶 赖氨酸 精氨酸 鸟氨酸 明胶 脲酶 V ︱P 42℃生长 蔗糖 D︱纤维二糖 乳糖 阿拉伯糖 D︱甘露糖 D︱甘露醇 ONPG 嗜盐性试验 氯化钠含量/％ 0 3 6 8 10 副溶血性弧菌 V. parahaemolyticus ＋ ＋ － ＋ ＋ V － ＋ － V － ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ － 创伤弧菌 V. vulnificus ＋ ＋ － ＋ ＋ － － ＋ － ＋ ＋ － ＋ V ＋ － ＋ ＋ － － 溶藻弧菌 V. alginolyticus ＋ ＋ － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ ＋ 霍乱弧菌 V. cholerae ＋ ＋ － ＋ ＋ － V ＋ ＋ － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － 拟态弧菌 V. mimicus ＋ ＋ － ＋ ＋ － － ＋ － － － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － 河弧菌 V. fluvialis ＋ － ＋ － ＋ － － V ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ V － 弗氏弧菌 V. furnissii ＋ － ＋ － ＋ － － － ＋ － － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － 梅氏弧菌 V. metschnikovii － ＋ ＋ － ＋ － ＋ V ＋ － － － ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ V － 霍利斯弧菌 V. hollisae ＋ － － － － － － nd － － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － － 注：nd 表示未试验；V表示可变。 微生物实验是作业文件 文件编号：XMCDC/WS-SP05 副溶血性弧菌检验操作程序 第5页 共5页 第一版第0次修订 颁布日期：2010年05月12日 6血清学分型（可选择项） 6.1制备：接种两管3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂试管斜面，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。用含3％氯化钠的5％甘油溶液冲洗3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养物，获得浓厚的菌悬液。 6.2 K抗原的鉴定：取一管上述制备好的菌悬液，首先用多价K抗血清进行检测，出现凝集反应时再用单个的抗血清进行检测。用蜡笔在一张玻片上划出适当数量的间隔和一个对照间隔。在每个间隔内各滴加一滴菌悬液，并对应加入一滴K抗血清。在对照间隔内加一滴3％氯化钠溶液。轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1 min。阳性凝集反应应可以立即观察到。 6.3 O抗原的鉴定：将另外一管的菌悬液转移到离心管内，121 ℃灭菌1 h。灭菌后4 000 r/min离心15 min，弃去上层液体，沉淀用生理盐水洗三次，每次4 000 r/min离心15 min，最后一次离心后留少许上层液体，混匀制成菌悬液。用蜡笔将玻片划分成相等的间隔。在每个间隔内加入一滴菌悬液，将O群血清分别加一滴到间隔内，最后一个间隔加一滴生理盐水作为自凝对照。轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片1 min。阳性凝集反应应可以立即观察到。如果未见到与O群血清的凝集反应，将菌悬液121 ℃再次高压1 h后，重新检测。如果仍旧为阴性，则培养物的O抗原属于未知。根据表3报告血清学分型结果。 表3 副溶血性弧菌的抗原 O群 K型 1 1，5，20，25，26，32，38，41，56，58，60