新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定作者：王静,张彦明*,仝钢,刘芳宁,周宏超,何雷,杨小云,徐彦召,洪海霞(西北农林科技大学动物医学院,杨凌712100)内容摘要:为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利,本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞。结果,利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株,获得的上皮细胞具有较强的增殖能力,22h内贴壁并发生细胞分裂,6~7d明显增殖,10~12d汇合成单层,连续传代培养至12代,细胞基本失去上皮样特征。倒置显微镜下观察,10代前培养细胞为多角状或卵圆形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列,11~12代细胞发生变形，间隙增大。细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性。电镜下,纹状缘整齐,紧密连接结构清晰可见。结果表明利用组织块培养法可以获得能够连续传代、活力较好的猪小肠上皮细胞。关键词:新生仔猪小肠上皮细胞；；组织块培养；原代培养；；鉴定中图分类号:Q813.1文献标识码:A文章编号:0366-6964(2010)01-0092-07动物细胞的体外培养已被广泛应用于细胞和分子生物学领域。就肠上皮细胞而言,分离培养技术成为深入研究小肠功能、病理和细胞分化的重要工具[1]。肠细胞培养物在生物技术和临床应用方面都有很高的价值,可用作食品、化妆品、抗肿瘤药品和移植药品等的毒力活性检测[2]。国外学者对肠上皮细胞研究较多,虽然分离方法各有不同,但多采用酶消化法,且多局限于小鼠、大鼠和人。啮齿动物肠细胞系如IEC-6[3-5]在研究多种隐窝细胞活性方面,包括增殖活性、细胞迁移、细胞外基质分子的合成[6-8],以及在研究细胞分化方面[6,8-9]都有很重要的意义,相继建成的还有IEC-18[10]。关于猪小肠上皮细胞系,国外已有学者成功建立了来源于成年公猪回肠的IPI-2I[11]以及来源于未吃初乳的乳猪空肠的IPEC-J2[12]和IPEC-1[13],但国内尚无猪小肠上皮细胞连续传代并成功建系的报道。本研究使用组织块培养法成功的培养了猪小肠上皮细胞,为构建小肠上皮细胞系奠定基础。一1、材料与方法（1.1一）材料无菌条件下取出刚出生12h内仔猪的回肠,剔除肠系膜,于加入双抗的PBS培养基中冰浴保存,备用。DMEM/F12培养基(Gibco):添加50mL#L-1的胎牛血清(Gibco)、10ng#mL-1EGF(Sigma)、100U#mL-1青霉素、100Lg#mL-1链霉素、1mmol#L-1的HEPES、ITS-G(Insulin1.0g#L-1+Transferring0.55g#L-1+Selenium0.67mg#L-1)蔗糖-EDTA缓冲溶液:0.45mol#mL-1蔗糖,3.6g#L-1EDTA,1g#L-1牛血清蛋白溶于PBS中,pH7.4。细胞角蛋白18单...
