细胞总蛋白提取方法.doc

细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1. 100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2. 100 mM PMSF 3. RIPA溶液 100ml 成分 分子量 终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠 0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。 ※使用前加入 成分 储存浓度 加入量 终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl 0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl 0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1. 细胞收取 1) 细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞 2) 弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。 分两次将细胞收至一个管中 3) 加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。 4) 待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃ 5) 弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×3min，4℃ 6) 重复PBS清洗一次 7) 弃上清，-80℃冻存待裂解 2. 蛋白提取 加入缓冲液前先将细胞沉淀敲散，加入后吹打细胞沉淀使其松散 1) 向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS、 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin)，混匀 后冰上放置40mins 2) 10,000rpm×15min，4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）