YYSWDB0090蛋白质含量测定福林酚法YY-SW-DB-0090蛋白质含量测定福林-酚法1.范围本方法采用蛋白质与福林酚试剂的显色反应-分光光度法测定蛋白质含量本方法适用于各类蛋白质测定范围0.2毫克2.0毫克的氮2.原理福林酚试剂Folinphenolreagent的显色原理是:首先在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物该复合物随之将磷钼酸磷钨酸还原成蓝色复合物在一定条件下蓝色强度与蛋白质量成正比蛋白质浓度范围约在25250gmL-1虽然该法是测定蛋白质浓度应用最广泛的方法之一但其缺点也很明显专一性较差干扰物质多如Tris缓冲剂蔗糖硫酸铵巯基化物酚类柠檬酸等标准曲线的直线关系不特别严格因此在其应用过程中有很多新的修正3.试剂碳酸钠,氢氧化钠,酒石酸钾钠或钠盐,硫酸铜CuSO45H2O,钨酸钠Na2W042H2O,钼酸钠(Na2Mo042H2O),磷酸,浓盐酸,硫酸锂,液体溴,酚酞,均为分析纯4.仪器72型分光光度计5.试样制备5.1试剂甲A1OgNa2CO32gNaOH和0.5g酒石酸钾钠或钠盐或钾盐溶于50OmL蒸馏水B0.5gCuSO45H2O溶于l00mL蒸馏水每次使用前将两溶液以A:B50:1混合此为试剂甲5.2试剂乙在1.5升的磨口回流瓶中加入10Og钨酸钠Na2W042H2O25g钼酸钠(Na2Mo042H2O)及70OmL蒸馏水再加5OmL85磷酸l00mL浓盐酸充分混合接上回流冷凝管以小火回流10小时回流结束后加入15Og硫酸锂50mL蒸馏水及数滴液体溴开口继续沸腾15分钟以便驱除过量的溴冷却后溶液呈黄色如仍呈绿色须再重复滴加液体溴的步骤将溶液稀稀至1升过滤滤液置棕色瓶中保存使用时用标准氢氧化钠滴定以酚酞为指示剂然后适当稀释约加1倍水使最终的酸浓度为1molmL-15.3标准蛋白质溶液取结晶牛血清白蛋白溶于蒸馏水浓度为250gmL-15.4未知蛋白质溶液取动物血清使用前稀释100倍6.操作步骤6.1按下表顺序加入各试剂试管编号123456789蛋白质含量g02550100150200250标准蛋白质溶液mLO.00.10.20.40.60.81.0未知蛋白质溶液mL///////0.51.0H2OmL1.00.90.80.60.40.2/0.5/试剂甲均加入5.0mL摇匀室温下放置10分钟试剂乙1mo1L-1均加入0.5mL立即混匀室温放置30分钟后比色7.结果计算以光密度(A650)对蛋白质含量作图然后利用未知样品的光密度值求其蛋白质含量8.说明8.1比色测定时的波长可选65Onm或660nm若蛋白质浓度在20100g可选用75Onm在660nm所读取的光密度为75Onm时的90若在125g以上可采用50Onm9.参考文献1李如亮主编.生物化学实验.武汉武汉大学出版社1998.37-582张龙翔等主编.生化实验方法和技术.北京高等教育出版社1997.136-1443李建武等合编.生物化学实验原理和方法.北京北京大学出版社1994.150-174
