解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1westernblotting检测实验方法1.实验原理蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即WesternBlot，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。[解螺旋http://www.helixlife.cn/]与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。2.实验目的获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。3.实验材料3.1.主要试剂（试剂来源仅供参考）试剂来源Cat.No.RIPA碧云天P0013CPMSFBio-RadMSB1001PierceBCAProteinAssayKitThermoScientific232254XLeammli加样缓冲液Bio-Rad1610747β巯基乙醇Sigmaaldrich60-24-2ProteinMarker天能180-6003脱脂奶粉生工A600669解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2WesternBlotStrippingBufferThermoScientific21059ECLWesternBlottingSubstrateThermoScientific32106解螺旋http://www.helixlife.cn/3.2.主要仪器仪器名称来源型号离心机ThermoScientificMicro17R恒温金属浴佑宁仪器MiniH-100L酶标仪BioTekEpoch-256600电泳仪上海天能EPS-300凝胶成像系统上海天能Tanon-6003.3.其他（请具体写明）蛋白marker需根据待检测蛋白分子的分子量选择合适的marker。4.实验步骤（简略版本）1.提取组织或细胞蛋白；2.测定蛋白质浓度；3.电泳，条件为：恒压100V，待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止（约120min）；4.电转膜仪转膜，条件为：恒流250mA，2h（时间可根据目的蛋白分子量适当调整）；5.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭1h；6.加一抗：一抗封膜之后室温条件下摇1h然后放入4℃冰箱中过夜；7.收一抗，PBST洗膜3次，10min/次；8.二抗孵育：室温孵育1h，所用二抗的比例和种属可参见抗体产品说明书；9.洗膜：PBST洗膜2次，PBS洗膜一次，10min/次；10.显色。（详细版本）...
