毕氏酵母（Pichiapastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1MLiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50%PEG3350（SigmaP3640用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/mlsalmonspermDNA/TE（10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachiapastoris到50mlYPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml100mMLiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul100mMLiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50%PEG3350240ul1MLiCl36ul2mg/ml单链SalmonspermDNA25ul5～10ug/50ulH2O质粒DNA50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1mlYPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0MSorbitol，10mMBicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethyleneglycol缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2MBicine，pH8.35缓冲液C：0.15MNaCl，10mMBicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachiapastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性...
