用Image-ProPlus(IPP)分析免疫组化图片1.免疫组化图片分析原理n根据染色染料颜色的深浅及分布面积大小来确定目标蛋白的量。n染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。n染色的颜色深浅与目标蛋白量的定量关系符合朗伯-比尔定律，是对数关系。1.1光密度与灰度—迷惑人的不同概念n光密度：吸收光的物质的光学密度。（opticaldensity,就是常说的OD值）光密度值是直接与染色物质的量相关的。n灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位。电子照片上像素的亮度称为灰度。Gray:betweenwhiteandblackExample:1.Thebrightvalueondisplayscreenisgrayvalue.2.Thedarkvalueonawhitepaperisalsothegrayvalue.255OpticalDensity:吸光物质的光学密度.n被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。nOD值与物质的量直接相关，数字图象上点的灰度值与对应物质OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。n理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用0-2.0或者0-3.0。用OD值是正确的n分光光度计与酶标仪的测定值是OD值n透射的显微镜图象上的光强度要用OD值n蛋白电泳条带的测量也是OD值。n萤光显微镜及萤光分光光度计的测量值是萤光强度(Fluorescenceintensity)n用EB染色的DNA凝胶电泳条带也是萤光强度，但处理方法与光密度相同，故也用OD值。这个OD与前面的OD又有不同的意义。它就是荧光的光密度。反映着荧光物质的多少。处理照片时用的却是灰度n各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时，计算机是对照片的灰度进行测量和计算的。为了定量物质含量，最后还是需要转换为OD值来表示。n所以对免疫组化照片的分析结果应该是一个OD值，光密度。不应该是灰度。n准确地说，是对免疫组化照片的特定染色区域的灰度进行分析从而测量出组织切片的光密度值。用标准样品才能把OD值与样品量关联到一起nOD值是一个没有单位的相对值。n使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。对电泳条带进行定量分析时一样要作标准曲线。n电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指数函数。在把灰度值转换成OD值时，用一个标准点进行定量分析是不准确的。多个标准点的标准曲线亦有很大误差，因此只能说是半定量分析。1.2定量分析的指标：IOD(Integratedoptiondensity)与MeanDensityn将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。此值与目标物质的总量成正比。nIOD值除以有效目标分布区域的面积，得到Meandensity，此值反映了目标物质的单位面积浓度。对样品照片进行数字图像分...
