解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1外泌体（示踪）外泌体具有典型的脂质双分子层结构；参与细胞之间的交流，物质的运输以及正常生理过程的维持。对分离的外泌体进行体外标记或活体示踪，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前对于外泌体的标记方法有很多种，包括亲脂性的染料和膜渗透型的化合物等。一、亲脂性染料1.实验原理染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞失踪研究。PKH67（green）的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67，PKH-26（red）具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。2.实验目的标记外泌体。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.实验材料3.1.主要试剂PKH-67/PKH-263.2.主要仪器电子显微镜4.实验步骤使用PKH67绿色荧光标记试剂盒（Sigma-Aldrich，MINI67）标记外泌体；将标记的外泌体与受体细胞37℃共温育12小时；将受体细胞固定并成像。二、亲脂性羰花青染料1.实验原理DiI,DiO,DiD,DiR是一系列亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2物结构。这些环境敏感性荧光染料在进入细胞膜之前荧光非常弱，当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强。且具有消光系数高、极性依赖性、激发态寿命短等特点。一旦进入细胞膜后，可在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。2.实验目的标记外泌体。3.实验材料3.1.主要试剂DiI/DiO/DiD/DiR3.2.主要仪器电子显微镜4.实验步骤外泌体用红色荧光亲脂性染料DiI，允许监测外来体运动。当被绿光激发并掺入膜中时，DiI发出强荧光，并且不会破坏膜的性质。将外泌体重悬浮于无菌PBS中，并与5μMDiI孵育10分钟。然后洗涤DiI-外泌体并在无菌PBS中重悬浮三次以除去游离的DiI和其他杂质（如脂蛋白）。解螺旋http://www.helixlife.cn/三、渗透型的化合物标记法1.实验原理羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯，常称为CFSE，可被动扩散进入细胞。这种试剂没有颜色和荧光，直至细胞内的酯酶去除其醋酸盐基团，产生能发出明亮荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应，形成稳定且能用醛固定剂固定的荧光偶联物。在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光...
